Shoot apical meristem (SAM) korriinka ayaa muhiim u ah dhismaha asliga ah. Hormoonnada dhirtagibberellins(GAs) ayaa door muhiim ah ka ciyaara isku-dubbaridka koritaanka dhirta, laakiin doorkooda SAM ayaa weli ah mid si liidata loo fahmay. Halkan, waxaanu ku samaynay ratiometric biosensor ee calaamadaynta GA anagoo injineerinayna borotiinka DELLA si loo xakameeyo shaqadeeda sharci ee muhiimka ah ee jawaabta qoraalka GA iyada oo la ilaalinayo hoos u dhaca aqoonsiga GA. Waxaan muujineynaa in biosensor-ku-saleysan xaalufku si sax ah u diiwaangeliyo isbeddellada heerarka GA iyo dareemada gacanta inta lagu jiro horumarka. Waxaan u isticmaalnay biosensor-kan si aan u khariideyno dhaqdhaqaaqa calaamadaynta GA ee SAM. Waxaan tusineynaa in calaamadaha GA ee sarreeya ay inta badan ku jiraan unugyo ku yaal inta u dhaxaysa xubnaha primordia, kuwaas oo horudhac u ah unugyada internode. Isticmaalka hababka faa'iidada iyo luminta shaqada, waxaan sii muujineynaa in GA ay maamusho jihada diyaaradda qaybinta unugyada, sameynta ururka unugyada unugyada internodes, taas oo kor u qaadeysa qeexida internode ee SAM.
Apical meristem (SAM), oo ku yaal cirifka ugu sarreeya, ayaa ka kooban qaybo badan oo unugyo asliga ah oo hawshoodu ay soo saarto xubnaha dambe iyo qanjidhada asliga ah si habaysan oo isdabajoog ah inta uu nool yahay geedka. Mid kasta oo ka mid ah unugyadan soo noqnoqda, ama noodhka dhirta, waxaa ku jira internodes iyo xubnaha lateral ee qanjidhada, iyo meerisyada axillary ee axils caleen1. Koritaanka iyo abaabulka qanjidhada dhirta ayaa isbeddelaya inta lagu jiro horumarka. Carabidopsis, koritaanka internodal waa la xakameeyaa inta lagu jiro marxaladda daaqsinka, iyo meerisyada axillary waxay ku sii nagaanayaan caleemaha rosette-ka. Inta lagu jiro u gudubka marxaladda ubaxa, SAM wuxuu noqdaa meerisemka inflorescence, taasoo dhalinaysa internodes dhaadheer iyo burooyinki axillary, laamo ku dhex jira caleemaha cauline, ka dibna, ubaxyo aan caleen lahayn2. In kasta oo aan horumar la taaban karo ka samaynay fahamka hababka xakameynaya bilaabista caleemaha, ubaxa, iyo laamaha, wax yar ayaa laga og yahay sida internodes u soo baxaan.
Fahamka qaybinta gaaska ee GA-yada waxay kaa caawin doontaa inaad si fiican u fahamto shaqooyinka hormoonnadan ee unugyo kala duwan iyo marxaladaha korriinka ee kala duwan. Aragtida hoos u dhaca isku-dhafka RGA-GFP ee lagu muujiyey ficilka dhiirrigeliyeheeda ayaa bixiya macluumaad muhiim ah oo ku saabsan nidaaminta wadarta guud ee heerarka GA ee xididdada15,16. Si kastaba ha ahaatee, tibaaxaha RGA way ku kala duwan yihiin unugyada17 waxaana nidaamiya GA18. Sidaa darteed, muujinta kala duwanaanta dhiirrigeliyaha RGA ayaa laga yaabaa inay keento qaabka fluorescence ee lagu arkay RGA-GFP sidaas darteed habkani maaha mid tiro badan. Dhawaanahan, bioactive fluorescein (Fl) oo lagu calaamadeeyay GA19,20 ayaa shaaca ka qaaday ururinta GA ee xididka endocortex iyo nidaaminta heerarkeeda gacanta ee gaadiidka GA. Dhawaan, dareenka GA FRET nlsGPS1 wuxuu muujiyay in heerarka GA ay la xiriiraan kororka unugyada xididdada, fiilo, iyo hypocotyls21-koray madow. Si kastaba ha ahaatee, sida aan aragnay, feejignaanta GA maaha kaliya halbeegga xakameynaya dhaqdhaqaaqa calaamadaha GA, maadaama ay ku xiran tahay hababka dareenka adag. Halkan, anagoo ka duulayna fahamkayaga dariiqooyinka calaamadaynta DELLA iyo GA, waxaanu ka warbixinaynaa horumarka iyo sifada hab-nololeed ku salaysan hoos-u-dhac ku salaysan calaamadaynta GA. Si loo horumariyo biosensor-ka tirada, waxaanu isticmaalnay GA-xasaasi ah RGA kaas oo lagu daray borotiinka fluorescent oo meel walba lagu muujiyay unugyo, iyo sidoo kale borotiinka fluorescent-ka ee GA. Waxaan tuseynaa in isku-dhafka borotiinka RGA-ga ee mutant aysan faragelin calaamadaha GA-ga ah marka si guud loo muujiyo, iyo in biosensor-kani uu qiyaasi karo dhaqdhaqaaqa calaamadaynta ee ka dhashay labadaba GA-gelinta GA-ga iyo hab-samaynta calaamadaha GA ee qalabka dareenka leh oo leh xallin heer sare ah. Waxa aanu u isticmaalnay biosensor-kan si aanu u khariideyno qaybinta meelaynta ee dhaqdhaqaaqa calaamadaynta GA oo aanu ku qiyaasno sida GA u habeeyo hab-dhaqanka gacanta ee epidermis-ka SAM. Waxaan muujineynaa in GA ay maamusho hanuuninta diyaaradda qaybinta unugyada SAM ee ku yaal inta u dhaxaysa xubnaha primordia, taas oo qeexaysa ururka unugyada canonical ee internode.
Ugu dambeyntii, waxaan weydiinay in qmRGA ay ka warbixin karto isbeddelada heerarka GA ee endogenous iyadoo la adeegsanayo hypocotyls. Waxaan hore u muujinnay in Nitrate-ku uu kiciyo koritaanka iyada oo kordhinaysa isku-dhafka GA iyo, markeeda, hoos u dhaca DELLA34. Sidaa darteed, waxaan aragnay in dhererka hypocotyl ee pUBQ10 ::qmRGA geedo ku koray sahayda Nitrate-ka ee tirada badan (10 mM NO3−) uu aad uga dheer yahay kan geedo lagu koray xaaladaha Nitrate-ku yar yahay (Jaantuska Dheeraadka ah 6a). Iyadoo la raacayo jawaabta korriinka, calaamadaha GA waxay ku badnaayeen hypocotyls ee geedo ka hoos baxa 10 mM NO3- xaaladaha geedo koray maqnaanshaha nitrate (Jaantuska Dheeraadka ah. 6b, c). Markaa, qmRGA waxay sidoo kale awood u siisaa la socodka isbeddelada ku yimaadda calaamadaynta GA ee ay keentay isbeddellada endogenous ee uruurinta GA.
Si loo fahmo in dhaqdhaqaaqa calaamadaha GA ee ay ogaatay qmRGA ay ku xiran tahay uruurinta GA iyo garashada GA, sida la filayo iyadoo lagu saleynayo naqshadda dareemayaasha, waxaan falanqeynnay muujinta seddexda soo-dhoweeyayaasha GID1 ee unugyada daaqsinka iyo taranka. Geedo, khadka wariyaha GID1-GUS wuxuu muujiyay in GID1a iyo c ay si weyn ugu muujiyeen cotyledons (Jaantus. 3a-c). Intaa waxaa dheer, dhammaan saddexda reseptors ayaa lagu muujiyay caleemaha, xididdada lateral primordia, talooyinka xididka (marka laga reebo xididka xididka GID1b), iyo nidaamka xididdada (Sawir 3a-c). Inflorescence SAM, waxaan ku ogaanay calaamadaha GUS ee GID1b iyo 1c (Jaantuska Dheeraadka ah. 7a-c). Isku-dhafka goobta ayaa xaqiijiyay qaababkan muujinta waxayna si dheeraad ah u muujisay in GID1c si isku mid ah loogu muujiyay heerarka hoose ee SAM, halka GID1b ay muujisay muujin sare oo ku saabsan hareeraha SAM (Jaantuska Dheeraadka ah. 7d-l). pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b turjumaada tarjumaadda ayaa sidoo kale daaha ka qaaday kala duwanaansho la qiimeeyay oo ah muujinta GID1b, laga bilaabo hooseeyo ama aan lahayn muujinta dhexe ee SAM ilaa muujinta sare ee xudduudaha xubnaha (Jaantuska Dheeraadka ah. 7m). Sidaa darteed, soo-dhoweynta GID1 si isku mid ah looguma qaybin guud ahaan iyo unugyada dhexdooda. Tijaabooyinkii xigay, waxaan sidoo kale ku aragnay in xad-dhaafka ah ee GID1 (pUBQ10 :: GID1a-mCherry) ay kordhisay dareenka qmRGA ee hypocotyls codsiga GA dibadda ah (Jaantus. 3d, e). Taas bedelkeeda, fluorescence lagu qiyaasay qd17mRGA ee hypocotyl waxay ahayd mid aan dareen lahayn daaweynta GA3 (Jaantus. 3f, g). Labada imtixaanba, geedo waxaa lagu daaweeyay xaddi sare oo GA (100 μM GA3) si loo qiimeeyo habdhaqanka degdega ah ee dareemayaasha, halkaasoo awoodda lagu xiro soo-dhoweynta GID1 la wanaajiyey ama lumay. Si wada jir ah, natiijooyinkani waxay xaqiijinayaan in qmRGA biosensor-ku u adeego shaqo isku dhafan oo ah GA iyo GA-dareemaha, waxayna soo jeedinayaan in muujinta kala duwanaanta soo-dhoweeyaha GID1 uu si weyn u beddeli karo qiiqa dareemayaasha.
Ilaa hadda, qaybinta calaamadaha GA ee SAM wali ma cadda. Sidaa darteed, waxaan isticmaalnay qmRGA-muujinta dhirta iyo pCLV3 :: mCherry-NLS stem cell reporter35 si loo xisaabiyo maab tiro badan oo ah waxqabadka calaamadaynta GA, oo diiradda saaraya lakabka L1 (epidermis; Jaantus. 4a, b, eeg Hababka iyo Hababka Dheeraadka ah), tan iyo L1 ayaa door muhiim ah ka ciyaara korriinka 36 xakamaynta SAM. Halkan, pCLV3 :: mCherry-NLS waxay bixisay tilmaame joomatari oo go'an oo lagu falanqeynayo qaybinta istaandarka GA ee waxqabadka37. Inkasta oo GA loo tixgeliyo inay lagama maarmaan u tahay horumarinta xubnaha lateral4, waxaan aragnay in calaamadaha GA ay ku hooseeyaan floral primordium (P) laga bilaabo marxaladda P3 (Jaantus. 4a, b), halka da'yarta P1 iyo P2 primordiums ay lahaayeen hawl dhexdhexaad ah oo la mid ah tan gobolka dhexe (Jaantus. 4a, b). Dhaqdhaqaaqa calaamadaynta GA ee sare ayaa laga helay xudduudaha asaasiga ah ee xubinta, laga bilaabo P1/P2 (dhinacyada xuduudaha) iyo kor u kaca P4, iyo sidoo kale dhammaan unugyada gobolka durugsan ee ku yaala inta u dhaxaysa primordia (Jaantus. 4a, b iyo Fig. 8a, b). Dhaqdhaqaaqa calaamadaha GA ee sare waxaa lagu arkay ma aha oo kaliya epidermis laakiin sidoo kale L2 iyo lakabyada sare ee L3 (Jaantuska Dheeraadka ah 8b). Qaabka calaamadaha GA ee lagu arkay SAM iyadoo la isticmaalayo qmRGA sidoo kale wax isbeddel ah kuma iman muddo ka dib (Jaantuska Dheeraadka ah. 8c–f, k). Inkasta oo dhismaha qd17mRGA uu si nidaamsan hoos ugu dhacay SAM ee dhirta T3 laga soo bilaabo shan xariiq oo madaxbannaan oo aan si faahfaahsan u astaysannay, waxaan awoodnay inaan falanqeyno qaababka fluorescence ee lagu helay pRPS5a :: VENUS-2A-TagBFP dhismaha (Sawir Dheeraad ah 8g-j, l). Xariiqdan kantaroolka, kaliya isbeddellada yaryar ee saamiga fluorescence ayaa laga helay SAM, laakiin xarunta SAM waxaan ku aragnay hoos u dhac cad oo lama filaan ah VENUS oo la xidhiidha TagBFP. Tani waxay xaqiijinaysaa in qaabka calaamadaynta ee qmRGA uu ka tarjumayo hoos u dhaca ku-tiirsanaanta GA ee mRGA-VENUS, laakiin sidoo kale waxay muujinaysaa in qmRGA laga yaabo inay qiimeeyaan dhaqdhaqaaqa calaamadaha GA ee xarunta meristem. Marka la soo koobo, natiijadeenu waxay daaha ka qaadaysaa qaabka calaamadaynta GA kaas oo ugu horrayn ka tarjumaysa qaybinta cudurka asaasiga ah. Qaybintan gobolada asaasiga ah (IPR) waxa sabab u ah si tartiib-tartiib ah oo loo asaasay dhaqdhaqaaqa sare ee GA ee u dhexeeya bilowga hore ee soo koraya iyo gobolka dhexe, iyadoo isla markaa uu hoos u dhaco dhaqdhaqaaqa GA-ga ee asaasiga ah (Jaantus 4c, d).
Qaybinta GID1b iyo GID1c reseptors (eeg kor) waxay soo jeedinaysaa in muujinta kala duwanaanta GA receptors ay gacan ka geysato qaabeynta qaabka GA ee waxqabadka calaamadaynta SAM. Waxaan la yaabnay in ururinta kala duwan ee GA ay ku lug yeelan karto iyo in kale. Si loo baadho suurtogalnimadan, waxaanu isticmaalnay nlsGPS1 GA FRET sensor21. Soo noqnoqoshada firfircoonida ee kordhay ayaa lagu ogaaday SAM ee nlsGPS1 oo lagu daaweeyay 10 μM GA4+7 100 min (Sawir Dheeraad ah Qaybinta boosaska ee nlsGPS1 inta jeer ee firfircoonida waxay muujisay heerar hoose oo GA oo ah lakabyada sare ee SAM, laakiin waxay muujiyeen inay sare u qaadeen bartamaha iyo xuduudaha SAM (Jaantus. 4e iyo Sawirka Dheeraadka 9a,c). Tani waxay soo jeedinaysaa in GA sidoo kale lagu qaybiyo SAM oo leh hannaan goobeed oo la mid ah kan ay muujisay qmRGA. Hab kaabsi ahaan, waxaanu sidoo kale kula macaamilay SAM leh fluorescent GA (GA3-, GA4-, GA7-Fl) ama Fl kaligiis sidii xakamayn taban. Calaamada Fl waxa lagu qaybiyey SAM oo dhan, oo ay ku jiraan gobolka dhexe iyo primordium, inkasta oo uu ahaa mid ka hooseeya (Jaantus. 4j iyo Jaantuska Dheeraadka ah 10d). Taas bedelkeeda, dhammaan saddexda GA-Fl waxay si gaar ah ugu urureen gudaha xudduudaha asaasiga ah iyo heerar kala duwan inta ka hartay IPR, iyadoo GA7-Fl ay ku ururtay qaybta ugu weyn IPR (Jaantus. 4k iyo Sawirka Dheeraadka 10a,b). Qiyaasta xoojinta fluorescence waxay muujisay in saamiga IPR iyo kuwa aan IPR ahayn uu ka sarreeyay GA-Fl-daaweeyay SAM marka la barbar dhigo Fl-daaweeyay SAM (Jaantus. 4l iyo Jaantuska Dheeraadka ah. 10c). Si wada jir ah, natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan in GA ay ku jirto xaddi sare oo unugyada IPR kuwaas oo ku yaal meel u dhow xudduudda xubinta. Tani waxay soo jeedinaysaa in qaabka SAM GA ee waxqabadka calaamaduhu ay ka soo baxaan labadaba muujinta kala duwanaanta GA-qaadayaasha GA iyo ururinta kala duwanaanta GA ee unugyada IPR ee u dhow xudduudaha xubnaha. Sidaa darteed, falanqaynteenu waxay daaha ka qaaday qaab aan la filayn oo ku saabsan calaamadaha GA, oo leh waxqabad hoose oo ka jira xarunta iyo hore ee SAM iyo dhaqdhaqaaqa sare ee IPR ee gobolka durugsan.
Si aan u fahamno doorka kala duwanaanshaha dhaqdhaqaaqa calaamadaynta GA ee SAM, waxaanu falanqeynay xidhiidhka ka dhexeeya waxqabadka calaamadaynta GA, ballaarinta unugyada, iyo qaybinta unugyada anagoo adeegsanayna sawirka wakhtiga-dhabta ah ee SAM qmRGA pCLV3 :: mCherry-NLS. Marka la eego doorka GA ee nidaaminta kobaca, isku xidhka togan ee cabbiraadaha ballaarinta unugyada ayaa la filayay. Sidaa darteed, waxaan marka hore barbar dhignay khariidadaha waxqabadka calaamadaha GA oo leh khariidado heerka koritaanka unugyada unugyada (sida wakiilka xoogga ballaarinta unugga ee unugga la bixiyay iyo unugyada gabdhaha ee qaybta) iyo khariidadaha anisotropy koritaanka, taas oo cabbiraysa jihada ballaarinta unugga (sidoo kale halkan loo isticmaalo unug la siiyay iyo unugyada gabdhaha ee qaybta; Fig. 5a,b, eeg Hababka iyo Hababka Dheeraadka ah). Khariidadahayada heerka kobaca unugyada SAM waxay la socdaan indho-indhayntii hore38,39, oo leh heerarka kobaca ugu yar ee xadka iyo heerka kobaca ugu badan ee ubaxyada soo koraya (Jaantus. 5a). Falanqaynta qaybta aasaasiga ah (PCA) waxay muujisay in dhaqdhaqaaqa calaamadaynta GA uu si xun ula xidhiidhay xoojinta kobaca unugyada (Jaantuska 5c). Waxaan sidoo kale tusnay in faasasyada ugu muhiimsan ee kala duwanaanshiyaha, oo ay ku jiraan soo-gelinta GA-ga iyo xoojinta koritaanka, ay ahaayeen kuwo udub-dhexaad u ah jihada lagu go'aamiyay muujinta sare ee CLV3, taas oo xaqiijinaysa ka-saarista unugyada xarunta SAM ee falanqaynta soo hadhay. Falanqaynta isku xidhka Spearman ayaa xaqiijisay natiijooyinka PCA-ga (Jaantuska 5d), taas oo muujinaysa in calaamadaha GA ee sare ee IPR aanay keenin balaadhinta unugyada sare. Si kastaba ha ahaatee, falanqaynta isku-xidhka ayaa muujisay xidhiidh yar oo togan oo u dhexeeya waxqabadka calaamadaha GA iyo koritaanka anisotropy (Jaantus 5c, d), oo soo jeedinaysa in GA-ga sare ee calaamadaynta IPR ay saameynayso jihada koritaanka unugyada iyo suurtogalka ah booska diyaaradda qaybinta unugyada.
a, b Khariidadaha kulaylka ee kobaca dusha sare (a) iyo korriinka anisotropy (b) ee SAM ayaa celcelis ahaan ka badan toddobada dhirta madax-bannaan (oo loo isticmaalo wakiillada xoogga iyo jihada ballaarinta unugga, siday u kala horreeyaan). Falanqaynta PCA-ga waxa ku jiray doorsoomayaasha soo socda: Calaamadaha GA, xoojinta korriinka dusha sare, anisotropy koritaanka dusha, iyo muujinta CLV3. Qaybta PCA-ga 1 ayaa inta badan si xun ugu xidhnayd xoojinta korriinka dusha sare oo si togan ula xidhiidha calaamadda GA. Qaybta PCA-ga 2 ayaa inta badan si togan ula xidhiidha koritaanka dusha sare ee anisotropy oo si xun ula xidhiidhay muujinta CLV3. Boqolkiiba waxay ka dhigan tahay kala duwanaanshiyaha lagu sharraxay qayb kasta. d Falanqaynta isku xidhka Spearman ee udhaxeysa calaamada GA, xoojinta korriinka dusha sare, iyo anisotropy koritaanka dusha sare ee miisaanka nudaha marka laga reebo CZ. Tirada midigta ku taal waa qiimaha Spearman rho ee u dhexeeya laba doorsoome. Xiddigohu waxay muujinayaan kiisas halka isku xidhka/isku xidhka taban uu aad muhiim u yahay. e 3D aragga ee Col-0 SAM L1 unugyada iyadoo la adeegsanayo microscopy confocal. Darbiyada unugga cusub ee lagu sameeyay SAM (laakin ma aha primordium) 10 saacadood ayaa midabaysan iyadoo loo eegayo qiyamkooda xagal. Bar midabka waxa lagu muujiyay geeska midig ee hoose. Gelinku wuxuu muujinayaa sawirka 3D ee u dhigma 0 saac. Tijaabada waxaa lagu soo celiyay laba jeer natiijooyin isku mid ah. f Sawirrada sanduuqyada waxay muujinayaan heerarka kala qaybinta unugyada IPR iyo kuwa aan IPR Col-0 SAM ahayn (n = 10 dhirta madaxbannaan). Xariiqda dhexe waxay tusinaysaa dhexda, xudduudaha santuuqyaduna waxay muujinayaan boqolleyda 25aad iyo 75aad. Whiskers waxay muujinayaan qiimaha ugu yar iyo kan ugu badan ee lagu go'aamiyay software R. Qiimaha P waxaa lagu helay t-tijaabada laba-dabo leh ee Welch. g, h jaantuska jaantuska muujinaya (g) sida loo cabbiro xagasha gidaarka unugga cusub (magenta) marka loo eego jihada radial ee ka imanaysa xarunta SAM (khadka dhibicda cad) (qiyaasmaha xagal ba'an oo keliya, ie, 0-90°, ayaa la tixgelinayaa), iyo (h) wareegyada/dabeed iyo jihooyinka radial ee gudaha meristem. i Istoogaraamyada inta jeer ee jihaynta diyaaradda qaybta unugga ee SAM (buluug madow), IPR (buluug dhexdhexaad ah), iyo kuwa aan IPR ahayn (buluug khafiif ah), siday u kala horreeyaan. Qiimaha P waxaa lagu helay imtixaan laba-dabo leh Kolmogorov-Smirnov. Tijaabada waxaa lagu soo celiyay laba jeer natiijooyin isku mid ah. j Jahwaynta diyaaradeed ee qaybta unugga ee inta jeer ee IPR agagaarka P3 (cagaar khafiif ah), P4 (cagaar dhexdhexaad ah), iyo P5 (cagaar madow), siday u kala horreeyaan. Qiimaha P waxaa lagu helay imtixaan laba-dabo leh Kolmogorov-Smirnov. Tijaabada waxaa lagu soo celiyay laba jeer natiijooyin isku mid ah.
Sidaa daraadeed, waxaanu ku xiganay baadhitaanka xidhiidhka ka dhexeeya calaamadaynta GA iyo dhaqdhaqaaqa qaybinta unugyada anagoo aqoonsanay derbiyada unugyada cusub ee la sameeyay inta lagu jiro baaritaanka (Jaantus. 5e). Habkani wuxuu noo oggolaaday inaan cabbirno inta jeer ee iyo jihada qaybinta unugyada. Waxaa la yaab leh, waxaan ogaanay in inta jeer ee qaybaha unugyada ee IPR iyo inta kale ee SAM (non-IPR, Fig. 5f) ay isku mid yihiin, taas oo muujinaysa in kala duwanaanshaha GA ee calaamadaha IPR iyo unugyada aan IPR aysan si weyn u saameynin qaybta unugyada. Tani, iyo xidhiidhka togan ee u dhexeeya calaamadaynta GA iyo koritaanka anisotropy, ayaa nagu kalliftay inaan tixgelinno bal in dhaqdhaqaaqa calaamadaha GA uu saameyn ku yeelan karo jihada diyaaradda qaybinta unugyada. Waxaan cabbirnay jihada gidaarka unugga cusub sida xagal ba'an oo la xiriirta dhidibka radial ee isku xira xarunta meristem iyo xarunta derbiga unugga cusub (Jaantus. 5e-i) waxaanan aragnay u janjeera cad oo loogu talagalay unugyada inay u qaybiyaan xaglaha u dhow 90 ° marka loo eego dhidibka shucaaca, oo leh inta ugu badan ee soo noqnoqda ee lagu arkay 70.2-80%) iyo 28 ° 2 ° 70-82% (Jaantus. 5e,i), oo u dhiganta qaybaha unugyada ee jihada wareega/wareega (Jaantus 5h). Si loo baaro wax ku biirinta calaamadaha GA ee hab-dhaqankan qaybinta unugga, waxaanu si gooni gooni ah u falanqeeyay cabbirada kala qaybinta unugyada IPR iyo kuwa aan IPR ahayn (Jaantus. 5i). Waxaan aragnay in qaybinta xagasha qaybta unugyada IPR ay ka duwan tahay kuwa aan IPR-ka ahayn ama unugyada SAM oo dhan, iyada oo unugyada IPR ay muujinayaan qayb sare oo ka mid ah qaybaha unugyada lateral / wareegyada, ie, 70-80 ° iyo 80-90 ° (33.86% iyo 30.71%, siday u kala horreeyaan, saamiga u dhigma). Sidaa darteed, indha-indhayntayadu waxay daaha ka qaadeen urur ka dhexeeya calaamadaynta GA-ga sare iyo jihaynta diyaaradda qaybta unugga ee u dhow jihada wareegga, oo la mid ah xidhiidhka ka dhexeeya dhaqdhaqaaqa calaamadaynta GA iyo koritaanka anisotropy (Jaantus. 5c, d). Si loo sii dhiso ilaalinta booska ee ururkan, waxaan ku qiyaasnay jihada diyaaradda qaybinta unugyada IPR ee ku hareeraysan primordium oo ka bilaabmaya P3, tan iyo markii ugu sarreeya ee GA ee waxqabadka calaamadaynta laga helay gobolkan laga bilaabo P4 (Jaantus. 4). Xaglaha kala qaybinta IPR ee ku wareegsan P3 iyo P4 ma muujin kala duwanaansho la taaban karo oo tirakoob ah, in kasta oo soo noqnoqda korodhka qaybaha unugyada dambe lagu arkay IPR agagaarka P4 (Jaantus. 5j). Si kastaba ha ahaatee, unugyada IPR ee ku wareegsan P5, farqiga u dhexeeya jihaynta diyaaradda qaybinta unugyadu waxay noqotey mid aad u muhiim ah, iyada oo kor u kaca soo noqnoqda ee qaybaha unugyada transverse (Jaantus. 5j). Isku soo wada duuboo, natiijooyinkani waxay soo jeedinayaan in calaamadaha GA ay xakameyn karaan jihada qaybaha unugyada ee SAM, taas oo la socota warbixinadii hore40,41 in calaamadaha GA ee sarreeya ay keeni karaan jihada dambe ee qaybaha unugyada IPR.
Waxaa la saadaaliyay in unugyada IPR-da aan lagu dari doonin primordia laakiin halkii internodes2,42,43. Jihaynta leexsan ee qaybaha unugyada ee IPR waxay dhalin kartaa abaabulka caadiga ah ee safafka dhaadheer ee isbarbar socda ee unugyada epidermal ee internodes. U fiirsashadayada kor lagu sharaxay waxay soo jeedinayaan in calaamadaha GA ay u badan tahay inay door ka ciyaaraan geeddi-socodkan iyadoo la xakameynayo jihada qaybinta unugyada.
Luminta shaqada dhowr hidde-sideyaasha DELLA waxay keentaa jawaab celinta GA, iyo della mutants ayaa loo isticmaali karaa si loo tijaabiyo mala-awaalkan44. Waxaan marka hore falanqeynay qaababka muujinta ee shanta hiddo-wadaha DELLA ee ku jira SAM. Fiyuuska qoraalka ee GUS line45 ayaa shaaca ka qaaday in GAI, RGA, RGL1, iyo RGL2 (ilaa xad aad uga yar) lagu muujiyay SAM (Jaantuska Dheeraadka ah. 11a-d). Isku-dhafka goobta wuxuu si dheeraad ah u muujiyay in GAI mRNA ay si gaar ah ugu ururto asalka hore iyo horumarinta ubaxyada (Jaantuska Dheeraadka ah 11e). RGL1 iyo RGL3 mRNA ayaa laga helay guud ahaan saqafkii SAM iyo ubaxyadii hore, halka RGL2 mRNA uu aad ugu badnaa gobolka xuduudka (Jaantuska Dheeraadka ah. 11f–h). Sawir-qaadista konfocal ee pRGL3 :: RGL3-GFP SAM waxay xaqiijisay muujinta lagu arkay isku-dhafka goobta waxayna muujisay in borotiinka RGL3 uu ku ururo qaybta dhexe ee SAM (Jaantuska Dheeraadka ah. 11i). Isticmaalka khadka pRGA :: GFP-RGA, waxaan sidoo kale ogaanay in borotiinka RGA uu ku ururo SAM, laakiin badnaantiisa ayaa hoos u dhacda xadka laga bilaabo P4 (Jaantuska Dheeraadka ah 11j). Waxaa xusid mudan, qaababka muujinta RGL3 iyo RGA waxay la socdaan dhaqdhaqaaqa calaamadaynta GA sare ee IPR, sida lagu ogaaday qmRGA (Jaantus. 4). Waxaa intaa dheer, xogtani waxay tilmaamaysaa in dhammaan DELLA-yada lagu muujiyey SAM iyo in hadalkoodu si wadajir ah u dhan yahay SAM oo dhan.
Marka xigta waxaanu falanqeynnay cabbirrada kala qaybinta unugyada ee nooca duurjoogta ah ee SAM (Ler, control) iyo gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 rgl3-4 della quintuple (global) mutants (Jaantus. 6a, b). Waxa xiisaha lihi leh, waxaanu ku aragnay isbeddel tirakoob oo muhiim ah oo ku saabsan qaybinta soo noqnoqoshada xagasha qaybinta unugga ee della mutant SAM marka la barbar dhigo nooca duurjoogta ah (Jaantus. 6c). Isbeddelkan ku yimi mutant-ga caalamiga ah ee della waxa sabab u ahaa korodhka soo noqnoqda ee 80-90 ° xaglaha (34.71% vs. 24.55%) iyo, ilaa xad ka yar, 70-80 ° xaglaha (23.78% vs. 20.18%), ie, u dhiganta qaybaha unugyada transverse (Jaantus. 6c). Inta jeer ee qaybaha aan isdhaafsaneyn (0-60°) ayaa sidoo kale ka hooseeya della mutant-ga caalamiga ah (Jaantus. 6c). Inta jeer ee qaybaha unugyada isdhaafka ah ayaa si weyn u kordhay SAM ee della mutant caalami ah (Jaantus. 6b). Inta jeer ee qaybaha unugyada transverse ee IPR ayaa sidoo kale ka sarreeyay della mutant-ga caalamiga ah marka loo eego nooca duurjoogta ah (Jaantus. 6d). Ka baxsan gobolka IPR, nooca duurjoogta ah ayaa lahaa qaybinta lebbisan ee xaglaha qaybinta unugyada, halka della mutant-ga caalamiga ah uu doorbiday qaybaha tangential sida IPR (Jaantus. 6e). Waxa kale oo aanu qiyaasnay hanuuninta qaybaha unugga ee SAM ee ga2 oxidase (ga2ox) mutants quintuple (ga2ox1-1, ga2ox2-1, ga2ox3-1, ga2ox4-1, iyo ga2ox6-2), ga- aan firfircoonayn asalka mutant kaas oo GA urursan. Iyadoo la raacayo korodhka heerarka GA, SAM ee quintuple ga2ox mutant inflorescence ayaa ka weynaa Col-0 (Jaantuska Dheeraadka ah. 12a, b), marka la barbar dhigo Col-0, ga2ox quintuple SAM waxay muujisay qaybsanaan kala duwan oo kala duwan ee xaglaha qaybinta unugga, iyadoo xagalku ka kordhayo 50° tan iyo 9 Jaantuska 12a–c). Markaa, waxaanu tusinaynaa in firfircoonida ka kooban ee calaamadaynta GA iyo ururinta GA ay keenayso kala qaybsanaanta unugyada dambe ee IPR iyo inta kale ee SAM.
a, b 3D muuqaalaynta lakabka L1 ee PI-stained Ler (a) iyo mutant della caalami ah (b) SAM iyadoo la adeegsanayo microscopy confocal. Darbiyada unugga cusub ee lagu sameeyay SAM (laakin ma aha primordium) in ka badan 10-saacadood ayaa la muujiyaa oo la midabeeyaa iyadoo loo eegayo qiyamkooda xagal. Gelitaanka wuxuu muujinayaa SAM saacada 0. Bar midabka waxa lagu soo bandhigay geeska midig ee hoose. Falaarta ku jirta (b) waxay tilmaamaysaa tusaale faylalka unugga ee isku xidhan ee ku jira mutant-ga caalamiga ah. Tijaabada waxaa lagu soo celiyay laba jeer natiijooyin isku mid ah. marka la barbardhigo inta jeer ee qaybinta qaybinta unugyada jihaynta diyaarada ee dhamaan SAM (d), IPR (e), iyo non-IPR (f) inta u dhaxaysa Ler iyo international della. Qiimaha P waxaa lagu helay iyadoo la adeegsanayo imtixaanka Kolmogorov-Smirnov oo laba-dabo leh. f, g 3D muuqaalaynta sawirada konfocal ee PI-stained SAM ee Col-0 (i) iyo pCUC2 :: gai-1-VENUS (j) dhirta transgenic. Panels (a, b) waxay muujinayaan gidaarada unugga cusub (laakin ma aha primordia) ee lagu sameeyay SAM 10 saac gudahood. Tijaabada waxaa lagu soo celiyay laba jeer natiijooyin isku mid ah. h–j Isbarbardhigga inta jeer ee qaybinta jihaynta diyaarada qaybinta unug ee ku yaala dhamaan SAM (h), IPR (i) iyo non-IPR (j) inta u dhaxaysa Col-0 iyo pCUC2 :: gai-1-VENUS dhirta. Qiimaha P waxaa lagu helay iyadoo la adeegsanayo imtixaanka Kolmogorov-Smirnov oo laba-dabo leh.
Marka xigta waxaanu tijaabinay saamaynta joojinta calaamadaha GA gaar ahaan IPR. Si taas loo gaaro, waxaan isticmaalnay dhiirigeliyaha koobka cotyledon 2 (CUC2) si aan u wadno muujinta borotiinka gai-1 ee xun ee ku dhexjira VENUS (ee pCUC2 :: gai-1-VENUS line). Nooca duurjoogta ah ee SAM, dhiirrigeliyaha CUC2 wuxuu wadaa muujinta inta badan IPR-yada SAM, oo ay ku jiraan unugyada xuduudaha, laga bilaabo P4 wixii ka dambeeya, iyo tibaax gaar ah oo la mid ah ayaa lagu arkay pCUC2 :: gai-1-VENUS dhirta (hoos eeg). Qaybinta xaglaha qaybinta unugyada ee SAM ama IPR ee pCUC2 :: dhirta gai-1-VENUS si weyn ugama duwana nooca duurjoogta ah, inkastoo si lama filaan ah aan u ogaanay in unugyada aan lahayn IPR ee dhirtaas loo qaybiyay inta jeer ee sare ee 80-90 ° (Jaantus 6f-j).
Waxa la soo jeediyay in jihada qaybinta unugyadu ay ku xidhan tahay joomatari SAM, gaar ahaan culayska xajinta ee uu dhaliyo curvature nudaha46. Sidaa darteed waxaanu waydiinay in qaabka SAM lagu bedelay della global mutant iyo pCUC2 :: gai-1-VENUS dhirta. Sidii hore loo sheegay12, cabbirka della mutant SAM wuxuu ka weynaa nooca duurjoogta ah (Jaantuska Dheeraadka ah. 13a, b, d). Isku-dhafka goobta ee CLV3 iyo STM RNA waxay xaqiijiyeen balaadhinta meerisemka ee mutants della waxayna sii muujisay fidinta dambe ee niche unugga asliga ah (Jaantuska Dheeraadka ah. 13e, f, h, i). Si kastaba ha ahaatee, curvature SAM ayaa la mid ahaa labada genotypes (Jaantuska Dheeraadka ah. 13k, m, n, p). Waxaan aragnay koror la mid ah cabbirka gai-t6 rga-t2 rgl1-1 rgl2-1 della mutant afar geesood ah iyada oo aan isbeddelin curvature marka la barbar dhigo nooca duurjoogta ah (Jaantuska Dheeraadka ah. 13c, d, g, j, l, o, p). Inta jeer ee hanuuninta qaybinta unugga ayaa sidoo kale saamaysay mutant-ga afar-jibbaaran ee della, laakiin ilaa xad ka yar marka loo eego mutant-ka della monolithic (Jaantuska Dheeraadka ah. 12d-f). Saamaynta qiyaastan, oo ay weheliso la'aanta saamaynta qalooca, waxay soo jeedinaysaa in dhaqdhaqaaqa RGL3 ee haraaga ah ee Della quadruple mutant uu xaddidayo isbeddelada jihada qaybta unugga ee ay sababtay luminta dhaqdhaqaaqa DELLA iyo in isbeddelada qaybaha unugyada dambe ay dhacaan iyada oo laga jawaabayo isbeddelada dhaqdhaqaaqa calaamadaynta GA halkii ay ka beddeli lahaayeen joomatari SAM. Sida kor lagu sharaxay, dhiirigeliyaha CUC2 wuxuu wadaa muujinta IPR ee SAM laga bilaabo P4 (Jaantuska Dheeraadka ah. 14a, b), liddi ku ah, pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM waxay lahayd cabbir yar laakiin qalooc sare leh (Jaantuska Dheeraadka ah. 14c-h). Isbeddelkan ku dhacay pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM morphology waxa laga yaabaa inay keento qaybinta culaysyada farsamo ee kala duwan marka la barbar dhigo nooca duurjoogta ah, kaas oo culaysyada wareegyada sare ay ka bilaabmaan masaafo gaaban oo u jirta xarunta SAM47. Haddii kale, isbeddelada pCUC2 :: gai-1-VENUS SAM morphology waxay ka dhalan kartaa isbeddelada guryaha farsamada ee gobolka oo ay keentay muujinta transgene48. Labada xaaladoodba, tani waxay qayb ahaan baabi'in kartaa saamaynta isbeddelada calaamadaha GA iyadoo kordhinaysa suurtagalnimada in unugyadu ay u qaybsamaan jihada wareegta/wareegga, sharraxaya indha-indhayntayada.
Isku soo wada duuboo, xogtayadu waxay xaqiijinaysaa in calaamadaha GA ee sare ay door firfircoon ka ciyaaraan jihaynta dambe ee diyaaradda qaybta unugga ee IPR. Waxay sidoo kale muujinayaan in curvature meerisem uu sidoo kale saameyn ku yeesho jihada diyaaradda qaybinta unugyada IPR.
Jihaynta leexsan ee diyaaradda qaybinta ee IPR, sababtoo ah dhaqdhaqaaqa calaamadaha GA ee sarreeya, waxay soo jeedinayaan in GA ay horay u habaysay faylka unugyada radial ee epidermis gudaha SAM si loo qeexo ururka gacanta oo hadhow laga heli doono internode epidermal. Runtii, faylalka unugyada noocan oo kale ah ayaa si joogta ah looga arki jiray sawirada SAM ee della mutants (Jaantus. 6b). Sidaa daraadeed, si loo sii sahamiyo shaqada korriinka ee qaabka booska GA ee calaamadaynta SAM, waxaan isticmaalnay sawir-qaadista waqti-dhaafka ah si aan u falanqeyno ururinta booska unugyada unugyada IPR ee nooca duurjoogta ah (Ler iyo Col-0), della mutants caalami ah, iyo pCUC2 :: gai-1-VENUS dhirta transgenic.
Waxaan ogaanay in qmRGA ay muujisay in dhaqdhaqaaqa calaamadaynta GA ee IPR ay ka korodhay P1/P2 oo ay sare u kacday P4, qaabkanina wuxuu ahaa mid joogto ah waqti ka dib (Jaantus. 4a-f iyo Jaantuska Dheeraadka ah. 8c-f, k). Si loo falanqeeyo ururinta boosaska unugyada IPR-ka ee sii kordhaya calaamadaha GA, waxaan ku calaamadeynay unugyada Ler IPR ee kor ku xusan iyo dhinacyada P4 iyadoo loo eegayo qaddarkooda koritaaneed ee la falanqeeyay 34 h ka dib markii ugu horeysay ee la eego, ie, in ka badan laba jeer oo balastar ah, oo noo ogolaanaya inaan raacno unugyada IPR inta lagu jiro horumarinta primordium ee P1 / P2 ilaa P4. Waxaan isticmaalnay saddex midab oo kala duwan: jaalaha ah unugyada lagu dhex daray primordium ee u dhow P4, cagaar kuwa ku jiray IPR, iyo guduudka kuwa ka qaybqaatay labada habraac (Jaantus 7a-c). At t0 (0 h), 1-2 lakabyada unugyada IPR ayaa lagu arkay P4 horteeda (Jaantus. 7a). Sida la filayo, marka unugyadan la qaybsado, waxay sameeyeen inta badan iyada oo loo marayo diyaaradda qaybinta transverse (Sawir 7a-c). Natiijooyin la mid ah ayaa la helay iyadoo la adeegsanayo Col-0 SAM (oo diiradda saaraya P3, oo xuduudkeedu la mid yahay P4 ee Ler), inkasta oo genotype this laablaaban oo laga sameeyay xudduudaha ubaxa ay si dhakhso ah u qariyeen unugyada IPR (Jaantus. 7g-i). Sidaa darteed, qaabka qaybinta unugyada IPR waxay horay u habeeyaan unugyada safafka radial, sida internodes. Abaabulka safafka radial iyo meelaynta unugyada IPR ee u dhexeeya xubnaha isdaba jooga ah waxay soo jeedinayaan in unugyadani yihiin faraca internodal.
Halkan, waxaan ku samaynay ratimetric GA signaling biosensor,qmRGA, taas oo u ogolaanaysa khariidad tireed ee waxqabadka calaamadaynta GA taasoo ka dhalatay isku darka GA iyo GA-qaadayaasha uruurinta iyada oo la yareynayo faragelinta wadooyinka calaamadaha endogenous, taas oo bixisa macluumaadka shaqada GA ee heerka gacanta. Si taas loo gaaro, waxaan dhisnay borotiinka DELLA oo la beddelay, mRGA, kaas oo lumiyay awoodda isku xidhka la-hawlgalayaasha is dhexgalka DELLA laakiin weli xasaasi u ah borotiinka GA-ku keeno. qmRGA waxay ka jawaabtaa isbeddellada qalaad iyo kuwa endogenous ee heerarka GA, iyo astaamaheeda firfircoonida leh waxay awood u siinayaan qiimaynta isbeddellada ku-meel-gaadhka ah ee waxqabadka calaamadaynta GA inta lagu jiro horumarka. qmRGA sidoo kale waa qalab aad u jilicsan maadaama lagu hagaajin karo unugyo kala duwan iyadoo la beddelayo dhiirrigeliyaha loo isticmaalo muujinta (haddii loo baahdo), oo la siiyo dabeecadda la ilaaliyo ee dariiqa calaamadaynta GA iyo motif PFYRE ee guud ahaan angiosperms, waxay u badan tahay in lagu wareejin karo noocyada kale22. Iyada oo la raacayo tan, isku-beddelka u dhigma ee bariiska SLR1 DELLA borotiinka (HYY497AAA) ayaa sidoo kale la muujiyey inuu xakameeyo dhaqdhaqaaqa dib-u-kicinta korriinka ee SLR1 iyada oo kaliya ay yaraynayso hoos u dhaca dhexdhexaadinta GA, oo la mid ah mRGA23. Waxaa xusid mudan, daraasadihii ugu dambeeyay ee Carabidopsis waxay muujiyeen in hal-bedelka amino acid ee qaybta PFYRE (S474L) uu beddelay dhaqdhaqaaqa qoraalka RGA iyada oo aan saameyn ku yeelan awooddeeda la falgalka wada-hawlgalayaasha qodobka qoraalka50. In kasta oo isbeddelkan uu aad ugu dhow yahay 3da beddelaad ee amino acid ee ku jira mRGA, daraasadadeennu waxay muujinayaan in labadan beddelaad ay beddelaan sifooyin kala duwan oo DELLA ah. In kasta oo inta badan wada-hawlgalayaasha qoraalka qoraalka ay ku xidhan yihiin LHR1 iyo SAW domains ee DELLA26,51, qaar ka mid ah asiidhyada amino ee kaydsan ee qaybta PFYRE ayaa laga yaabaa inay gacan ka geystaan xasilinta isdhexgalkan.
Horumarinta internode waa astaan fure u ah qaab dhismeedka dhirta iyo horumarinta wax soo saarka. qmRGA waxay daaha ka qaaday dhaqdhaqaaqa calaamadaynta GA sare ee unugyada IPR internode progenitor. Marka la isku daro sawir-qaadista tirada iyo hiddaha, waxaan tusnay in qaababka calaamadaha GA ay ka sarreeyaan diyaaradaha qaybinta unugyada wareega/wareegga ee SAM epidermis, qaabaynta ururka qaybta unugga ee looga baahan yahay horumarinta internode. Dhawr maamulayaal ee hanuuninta diyaaradda qaybta unugga ayaa la aqoonsaday intii lagu jiray horumarka52,53. Shaqadeenu waxay bixisa tusaale cad oo ku saabsan sida dhaqdhaqaaqa calaamadaynta GA u habeeyo cabbirka gacanta. DELLA waxay la falgeli kartaa isku-duubnaanta borotiinka hore41, markaa calaamadda GA waxay nidaamin kartaa jihaynta diyaaradda qaybinta unugyada iyadoo si toos ah u saameynaysa jihaynta microtubule cortical40,41,54,55. Waxaan si lama filaan ah u muujinnay in SAM, isku-xirnaanta dhaqdhaqaaqa calaamadaha GA ee sare ma ahayn unug-dheeraynta ama qaybinta, laakiin kaliya anisotropy koritaanka, taas oo la socota saameynta tooska ah ee GA ee jihada qaybta unugyada IPR. Si kastaba ha ahaatee, kama saari karno in saamayntani ay sidoo kale noqon karto mid aan toos ahayn, tusaale ahaan waxaa dhexdhexaadinaya GA-ku-jilicsanaanta gidaarka unugyada56. Isbeddelada guryaha gidaarka unuggu waxay keenaan stress farsamo57,58, kaas oo sidoo kale saamayn ku yeelan kara hanuuninta diyaaradda qaybinta unugyada iyadoo saamaynaysa hanuuninta microtubules cortical39,46,59. Saamaynta isku-darka ah ee cadaadiska farsamada ee GA-ku-abuuray iyo nidaaminta tooska ah ee jihaynta microtubule ee GA ayaa laga yaabaa inay ku lug yeelato abuurista qaab gaar ah oo ku wajahan qaybta unugga ee IPR si loo qeexo internodes, iyo daraasado dheeraad ah ayaa loo baahan yahay si loo tijaabiyo fikradan. Sidoo kale, daraasadihii hore ayaa muujiyay muhiimada ay leedahay DELLA-isdhexgalka borotiinka TCP14 iyo 15 ee xakamaynta qaabka internode60,61 iyo arrimahan ayaa dhexdhexaadin kara ficilka GA oo ay weheliyaan BREVIPEDICELLUS (BP) iyo PENNYWISE (PNY), kuwaas oo nidaamiya horumarinta internode waxaana lagu muujiyay inay saameyn ku yeelanayaan GA signaling2,62. Marka la eego in DELLAs ay la falgalaan brassinosteroid, ethylene, jasmonic acid, iyo abscisic acid (ABA) waddooyinka calaamadaha63,64 iyo in hormoonnadani ay saameyn ku yeelan karaan hanuuninta microtubule65, saameynta GA ee jihaynta qaybta unugyada ayaa sidoo kale laga yaabaa inay dhexdhexaadiyaan hormoonno kale.
Daraasadihii hore ee cytological waxay muujiyeen in labada gudaha iyo dibedda ee Arabidopsis SAM labadaba looga baahan yahay horumarinta internode2,42. Xaqiiqda ah in GA si firfircoon u nidaamiyo kala qaybinta unugyada unugyada gudaha12 waxay taageertaa laba shaqo oo GA si loo xakameeyo meerisemka iyo cabbirka internode ee SAM. Habka qaybinta unugyada jihada ayaa sidoo kale si adag loogu habeeyey unugyada SAM ee gudaha, xeerkanina wuxuu muhiim u yahay koritaanka asliga52. Waxay noqon doontaa mid xiiso leh in la baaro in GA sidoo kale uu door ka ciyaaro jihaynta diyaaradda qaybinta unugyada gudaha ururka SAM, si la mideeyo qeexida iyo horumarinta internodes gudaha SAM.
Dhirta waxaa lagu koray in vitro ciidda ama 1x Murashge-Skoog (MS) dhexdhexaad ah (Duchefa) kabid 1% sucrose iyo 1% agar (Sigma) hoos xaaladaha caadiga ah (16 h iftiin, 22 °C), marka laga reebo hypocotyl iyo tijaabo koritaanka xididka kaas oo geedo lagu koray on taarikada toosan hoos iftiin joogto ah iyo 22 °C. Tijaabooyinka Nitrate-ka, dhirta ayaa lagu koray MS dhexdhexaad ah oo la beddelay (dhexdhexaadka dhirta bioWORLD) oo lagu kabay nitrate ku filan (0 ama 10 mM KNO3), 0.5 mM NH4-succinate, 1% sukrose iyo 1% A-agar (Sigma) oo hoos imanaya xaalado maalin dheer ah.
GID1a cDNA ee la geliyey pDONR221 waxaa dib loogu daray pDONR P4-P1R-pUBQ10 iyo pDONR P2R-P3-mCherry oo la galiyey pB7m34GW si loo dhaliyo pUBQ10::GID1a-mCherry. IDD2 DNA la geliyey pDONR221 ayaa dib loogu daray pB7RWG266 si loo dhaliyo p35S: IDD2-RFP. Si loo soo saaro pGID1b :: 2xmTQ2-GID1b, jajab 3.9 kb ah oo kor u kaca gobolka GID1b codeing iyo 4.7 kb jajab ah oo ka kooban GID1b cDNA (1.3 kb) iyo terminator (3.4 kb) ayaa markii hore la xoojiyay iyadoo la adeegsanayo aasaasayaasha gudaha PDOPN 3mo Fisher Scientific) iyo pDONR P2R-P3 (Thermo Fisher Scientific), siday u kala horreeyaan, oo ugu dambeyntii dib loogu daray pDONR221 2xmTQ268 galay pGreen 012567 bartilmaameedka bartilmaameedka iyadoo la isticmaalayo Gateway cloning. Si loo dhaliyo pCUC2 :: LSSmOrange, taxanaha dhiirigeliyaha CUC2 (3229 bp korka ATG) oo ay ku xigto taxanaha koodh ee mOrange weyn ee Stokes-shifted mOrange (LSSmOrange) 69 oo leh calaamad N7 meelaynta nukliyeerka iyo NOS transcriptional terminator ayaa la isugu keenay pGreen-gareen-gareen-gareen nidaamka dib-u-habaynta (Invitrogen). Caleemaha binary-ga dhirta waxaa lagu soo galiyay Agrobacterium tumefaciens strain GV3101 waxaana lagu soo galiyay Nicotiana benthamiana caleemaha habka Agrobacterium infiltration iyo Arabidopsis thaliana Col-0 iyadoo la raacayo habka ubaxa ubaxa, siday u kala horreeyaan. pUBQ10::qmRGA pUBQ10::GID1a-mCherry iyo pCLV3::mCherry-NLS qmRGA ayaa laga soocay farcanka F3 iyo F1 ee iskutallaabyada kala duwan, siday u kala horreeyaan.
Isku-dhafka RNA ee goobta waxaa lagu sameeyay qiyaastii 1 cm dheer tirooyinka toogashada72, kuwaas oo la soo aruuriyay oo isla markiiba lagu hagaajiyay xalka FAA (3.7% formaldehyde, 5% acetic acid, 50% ethanol) horay loo qaboojiyey ilaa 4 °C. Ka dib 2 × 15 min daawaynta faakuumka, hagaajinta waa la bedelay oo muunado ayaa la duray habeenkii. GID1a, GID1b, GID1c, GAI, RGL1, RGL2, iyo RGL3 cDNAs iyo baaritaannada lidka ku ah 3'-UTRs ayaa la sameeyay iyada oo la adeegsanayo aasaasayaasha lagu muujiyey Shaxda 3 ee Dheeraadka ah sida lagu qeexay Rosier et al.73. Baaritaannada Digoxigenin-ku calaamadeysan ayaa lagu tijaabiyay iyadoo la adeegsanayo digoxigenin antibodies (3000-laab dilution; Roche, lambarka buugga: 11 093 274 910), iyo qaybaha waxaa lagu dheehday 5-bromo-4-chloro-3-indolyl phosphate (BCIP, 250etrobt) 200 laab) xal.
Waqtiga boostada: Febraayo-10-2025