Waad ku mahadsan tahay booqashada Nature.com.Nooca browserka aad isticmaalayso waxa uu leeyahay taageerada CSS oo xadidan.Natiijooyinka ugu wanaagsan, waxaan kugula talineynaa inaad isticmaasho nooc cusub oo biraawsarkaaga ah (ama aad damiso Habka Laqabsiga ee Internet Explorer).Dhanka kale, si loo hubiyo taageerada socota, waxaan muujineynaa goobta iyada oo aan la habeynin ama JavaScript.
Helitaanka iyo isticmaalka faa'iidada leh ee alaabta dabiiciga ah waxay gacan ka geysan kartaa hagaajinta nolosha aadanaha.Kiimikooyinka ka hortagga koritaanka dhirta ayaa si weyn loogu isticmaalaa herbicides si loo xakameeyo haramaha.Sababtoo ah baahida loo qabo isticmaalka noocyada kala duwan ee herbicides, waxaa jira baahi loo qabo in la aqoonsado xeryahooda leh habab cusub oo ficil ah.Daraasaddan, waxaan ku ogaanay N-alkoxypyrrole-cusub, coumamonamide, oo ka yimid Streptomyces werraensis MK493-CF1 waxayna dejisay habka isku-dhafka oo dhammaystiran.Anagoo adeegsanayna qiimeynta dhaqdhaqaaqa nafleyda, waxaan ku ogaanay in urs-monoamic acid uu yahay dhexdhexaad ka sameysan urs-monoamide iyo suurtagalxakameynta koritaanka dhirta.Intaa waxaa dheer, waxaan soo saarnay derivatives urbenonic acid kala duwan, oo ay ku jiraan urbenyloxy derivative (UDA), kaas oo leh firfircoonida herbicidal sare iyada oo aan si xun u saameynayn koritaanka unugyada HeLa.Waxaan sidoo kale ogaanay in derivatives urmotonic acid ay carqaladeeyaan microtubules dhirta;Intaa waxaa dheer, KAND waxay saamaysaa falcelinta actin waxayna keentaa dhimashada unugyada;Saamayntan dhinacyo badan leh waxay ka duwan tahay kuwa loo yaqaan 'microtubule inhibitors' waxayna soo jeedinayaan hab cusub oo ficil ah oo loogu talagalay ursonic acid, taas oo ka dhigan faa'iido muhiim ah oo ku saabsan horumarinta herbicides cusub.
Helitaanka iyo adeegsiga wax ku oolka ah ee alaabta dabiiciga ah ee faa'iidada leh iyo kuwa ka soo jeeda ayaa ah hab lagu wanaajiyo tayada nolosha aadanaha.Dheef-shiid kiimikaad sare oo ay soo saareen nooleyaal, dhir iyo cayayaan ayaa horseeday horumar weyn oo xagga daawaynta iyo beeraha ah.Antibiyootigyo badan iyo dawooyin ka-hortagga kansarka ayaa laga soo saaray alaab dabiici ah.Intaa waxaa dheer, noocyada kala duwan eesunta cayayaanka, fungicides iyo herbicides ayaa laga soo saaraa waxyaabahan dabiiciga ah ee loo isticmaalo beeraha.Gaar ahaan, ka hortagga haramaha ayaa ah qalab muhiim u ah kordhinta wax-soo-saarka dalagga ee beeraha casriga ah, iyo noocyo kala duwan oo isku dhis ah ayaa horayba ganacsi ahaan loo isticmaalay.Dhowr geeddi-socodka gacanta ee dhirta, sida photosynthesis, dheef-shiid kiimikaadka amino acid, isku-darka gidaarka unugyada, nidaaminta mitosis, calaamadaynta phytohormone, ama borotiinka, ayaa loo tixgeliyaa bartilmaameedyada caadiga ah ee herbicides.Isku-dhafka xannibaya shaqada microtubule waa nooc caadi ah oo ka mid ah herbicides kuwaas oo saameeya koritaanka dhirta iyaga oo saameeya nidaamka mitotic2.
Microtubules waa qaybo ka mid ah cytoskeleton waxaana si weyn loogu keydiyaa unugyada eukaryotic.Tubulin heterodimer wuxuu ka kooban yahay α-tubulin iyo β-tubulin samaynta borotofilamentiyada microtubule toosan, oo leh 13 borotofilaments samaynta qaabdhismeedka cylindrical.Microtubules waxay ka ciyaaraan doorar badan oo ku jira unugyada dhirta, oo ay ku jiraan go'aaminta qaabka unugyada, qaybta unugyada, iyo gaadiidka gudaha3,4.Unugyada dhirta waxaa ku jira microtubules oo ka hooseeya xuubka balaasmaha interphase, iyo kuwan loo yaqaan 'cortical microtubules' ayaa loo maleynayaa inay xakameynayaan abaabulka microfibrils cellulose iyada oo loo marayo nidaaminta unugyada synthase cellulose4,5.Microtubules Cortical ee unugyada epidermal xididka, oo jooga aagga dhererka degdega ah ee caarada xididka, waxay ku yaalaan dhinaca dambe, iyo microfibers cellulose waxay raacaan microtubules-kan waxayna xaddidaan jihada ballaarinta unugyada, taas oo kor u qaadeysa koritaanka unugyada anisotropic.Sidaa darteed, shaqada microtubule waxay si dhow ula xiriirtaa qaab-dhismeedka dhirta.Beddelaadaha Amino acid ee hiddo-wadaha codeeynta tubulin waxay sababaan qalfoofka arraysyada microtubule kortikal iyo korriinka bidix ama midig ee Arabidopsis 6,7.Sidoo kale, isbeddellada ku jira borotiinnada ku xiran microtubule ee xakameynaya dhaqdhaqaaqa microtubule waxay sidoo kale u horseedi karaan koritaanka xididka qalloocan8,9,10,11,12,13.Intaa waxaa dheer, daawaynta microtubule-qalalan herbicides sida disopyramide, oo sidoo kale loo yaqaan pretilachlor, ayaa sidoo kale sababa koritaanka xididka garabka bidix ee garabka bidix14.Xogtaasi waxay tilmaamaysaa in nidaaminta saxda ah ee shaqada microtubule ay muhiim u tahay go'aaminta jihada koritaanka dhirta.
Noocyo kala duwan oo ah inhibitors microtubule ayaa la helay, dawooyinkani waxay wax weyn ka tartay cilmi-baarista cytoskeletal, iyo sidoo kale beeraha iyo daawada2.Gaar ahaan, oryzalin, xeryahooda dinitroaniline, disopyramide, xeryahooda la xidhiidha benzamide, iyo analogs-koodu waxay joojin karaan shaqada microtubule oo ay joojiyaan koritaanka dhirta.Sidaa darteed, waxaa si ballaaran loo isticmaalaa sida herbicides.Si kastaba ha ahaatee, maadaama microtubules ay yihiin qayb muhiim ah oo ka mid ah unugyada dhirta iyo xayawaanka, inta badan inhibitors microtubule waa cytotoxic labadaba noocyada unugyada.Sidaa darteed, inkastoo ay u aqoonsan yihiin isticmaalka sida herbicides, tiro kooban oo ah wakiilada antimicrotubule ayaa loo isticmaalaa ujeedooyin wax ku ool ah.
Streptomyces waa isir ka mid ah qoyska Streptomyces, oo ay ku jiraan aerobic, gram-positive, bakteeriyada filamentous waxayna caan ku tahay awoodda ay u leedahay inay soo saarto tiro balaadhan oo ah dheef-shiid kiimikaad sare.Sidaa darteed, waxaa loo tixgeliyaa mid ka mid ah ilaha ugu muhiimsan ee alaabta dabiiciga ah ee cusub ee firfircoon.Daraasadda hadda jirta, waxaan helnay xarun cusub oo loo yaqaan 'coumamonamide', taas oo ka go'day Streptomyces werraensis MK493-CF1 iyo S. werraensis ISP 5486. Iyadoo la adeegsanayo falanqaynta spectral iyo falanqaynta muuqaal buuxa, qaab dhismeedka coumamonamide ayaa lagu sifeeyay iyo qalfoofka N-alkoxypyrrole gaar ah. ayaa la go'aamiyay.isku duubni.Ursmonic acid, oo ah dhexdhexaad dhexdhexaad ah oo ah ursmonoamide iyo ka-soo-saarkeeda, ayaa la ogaaday inay joojiso koritaanka iyo biqilka geedka caanka ah ee Arabidopsis thaliana.Daraasad ku saabsan xiriirka qaab-dhismeedka, waxaan ogaanay in isku-dhafka leh C9 loo beddelay ursonic acid, oo loo yaqaan 'nonyloxy derivative of ursonic acid' (KAND), waxay si weyn u kordhisaa saameynta xannibaadda ee koritaanka iyo biqilka.Waxaa xusid mudan, horjoogaha koritaanka dhirta ee dhowaan la helay sidoo kale wuxuu saameeyay koritaanka tubaakada iyo beeryarada mana ahayn cytotoxic bakteeriyada ama unugyada HeLa.Waxaa intaa dheer, qaar ka mid ah derivatives urmotonic acid waxay keenaan phenotype xidid qalloocan, taas oo tilmaamaysa in ka-soo-baxyadan si toos ah ama si aan toos ahayn u saameeyaan microtubules.Iyadoo la raacayo fikraddan, indha-indhayntayada microtubules ee lagu calaamadeeyay difaac-kimiko ahaan ama borotiinada fluorescent waxay muujinayaan in daaweynta KAND ay dejiso microtubules.Intaa waxaa dheer, daawaynta ka soo jeeda kumamotonic acid ayaa carqaladeeyay microfilaments actin.Sidaa darteed, waxaanu helnay xannibaade cusub oo koritaanka dhirta kaas oo habka gaarka ah ee falku ku lug leeyahay burburinta cytoskeleton.
Cadaadiska MK493-CF1 ayaa laga soocay ciidda Shinagawa-ku, Tokyo.Cadaadiska MK493-CF1 wuxuu sameeyay stromal mycelium oo si fiican u laantiisa.Taxanaha qayb ka mid ah hiddo-wadaha 16S ribosomal RNA (1422 bp) ayaa la go'aamiyay.Cadaadiskani wuxuu aad ugu eg yahay S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: nooca caadiga ah, 99.93%).Iyada oo ku saleysan natiijadan, waxaa la go'aamiyay in culeyskani uu si dhow ula xiriiro nooca nooca S. werraensis.Sidaa darteed, waxaan si ku meel gaar ah ugu magac daray noocaan S. werraensis MK493-CF1.S. werraensis ISP 5486T sidoo kale waxay soo saartaa isku xeryahooda bioactive.Maaddaama ay jirtay cilmi-baaris yar oo hore oo lagu helay wax soo saarka dabiiciga ah ee microorganism-ka, cilmi-baaris kiimikaad oo dheeraad ah ayaa la sameeyay.Ka dib markii la beero S. werraensis MK493-CF1 ee dhexdhexaadka ah shaciir by halsano-state adag at 30 ° C muddo 14 maalmood ah, dhexdhexaad ah ayaa la soo saaray 50% EtOH.60 ml oo muunad ah ayaa la qalajiyey si loo helo 59.5 mg oo laga soosaaray cayriin.Soosaarka cayriin ayaa lagu sammeeyay wejiga HPLC-ga beddelka si loo siiyo N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, oo lagu magacaabo coumamonamide, 36.0 mg).Tirada guud ee 1 waa ku dhawaad 60% soosaarka cayriin.Sidaa darteed, waxaan go'aansanay inaan si faahfaahsan u baranno sifooyinka kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 waa budo amorphous ah oo cad iyo qiyaasta qiyaasta qiyaasta sare (HRESIM) waxay xaqiijisaa C6H8N2O2 (Jaantus. 1).C2-la beddelo jajabka pyrrole ee xaruntan waxaa lagu gartaa δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH ee 1H NMR spectrum: 4.5 Hz , H-5) iyo δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), iyo 13C NMR spectrum waxay muujinaysaa joogitaanka afar atamka carbon sp2.Joogitaanka kooxda amide ee booska C2 waxaa lagu qiimeeyay isku xirnaanta HMBC ee ka timid C-3 proton ilaa kaarboonka amide carbonyl ee δC 161.1.Intaa waxaa dheer, 1 H iyo 13 C NMR ee ugu sarreeya δH 4.10 (3H, S) iyo δC 68.3 waxay muujinayaan joogitaanka kooxaha N-methoxy ee molecule.In kasta oo booska saxda ah ee kooxda methoxy aan wali la go'aamin iyadoo la adeegsanayo falanqaynta spectroscopic sida kala duwanaanshaha spectroscopy ee la xoojiyay iyo soo gaabinta Nukliyeerka Overhauser (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide wuxuu noqday isku-darka musharaxa ugu horreeya.
Si loo go'aamiyo qaabka saxda ah ee 1, wadarta guud ayaa la sameeyay (Jaantus 2a).Daawaynta ganacsi ahaan loo heli karo 2-aminopyridine 2 ee leh m-CPBA waxay keentay N-oxide 3 oo u dhiganta waxsoosaarka tirada.Ka dib 2-aminoazidation of 2, falcelinta cyclocondensation ee lagu tilmaamay Abramovich waxaa lagu fuliyay benzene at 90 ° C si loo helo 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 ee garaamyada la rabo.Xawaaraha 60% (laba marxaladood).15,16.Methylation iyo hydrolysis of 4 ka dib waxay siiyeen 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (oo loo yaqaan "cumotonic acid", 6) wax soo saar wanaagsan (70%, laba tallaabo).Ugu dambayntii, dhex-dhexaadinta aashitada chloride dhexda 6 iyadoo la isticmaalayo ammonia aqueous waxay siisay Kumamoto amide 1 98% wax soo saar.Dhammaan xogta muuqaalka ah ee isku-dhafka 1 waxay la mid yihiin 1 go'doonsan, sidaas darteed qaab-dhismeedka 1 ayaa la go'aamiyay;
Isku-dubaridka guud iyo falanqaynta dhaqdhaqaaqa noolaha ee urbenamide iyo urbenic acid.(a) Wadarta guud ee Kumamoto amide.(b) Geedo todobo-maalmood jir ah oo duurjoogta ah oo Arabidopsis Columbia (Col) ah ayaa lagu beeray Murashige iyo Skoog (MS) taarikada ka kooban coumamonamide 6 ama coumamonamide 1 marka la eego qiyaasta la tilmaamay.Baaxadda miisaanka = 1 cm.
Marka hore, waxaanu qiimeynay hawlaha bayoolojiga ee urbenamide iyo dhexdhexaadinteeda si ay u hagaajiyaan koritaanka dhirta.Waxaan ku darnay uruurin kala duwan oo ursmonamide 1 ama ursmonic acid 6 in MS agar dhexdhexaad ah iyo geedo Arabidopsis thaliana dhaqameed on dhexdhexaad this.Qiimayntani waxay muujisay in uruurinta sare (500 μM) ee 6 ay joojisay koritaanka xididka (Jaantus. 2b).Marka xigta, waxaan soo saarnay kala duwanaansho kala duwan annagoo ku beddelayna booska N1 ee 6 oo aan ku sameynay daraasado qaab-dhismeed-shaqo iyaga ah (habka isku-dhafka analogga ayaa lagu qeexay Macluumaadka Taageerada (SI)).Geedo Arabidopsis ah ayaa lagu beeray dhex dhexaad ka kooban 50 μM ursonic acid derivatives, iyo dhererka xididka ayaa la qiyaasay.sida ka muuqata sawirka.Sida lagu muujiyey jaantusyada 3a, b, iyo S1, coumamo acids waxay leeyihiin dherer kala duwan oo silsiladaha alkoxy toosan ah (9, 10, 11, 12, iyo 13) ama silsilado alkoxy waaweyn ah (15, 16, iyo 17) ee booska N1.Soosaarayaashu waxay muujiyeen xannibaad weyn oo koritaanka xididka.Intaa waxaa dheer, waxaan ogaanay in codsiga 200 μM 10, 11, ama 17 uu xannibay biqilka (Sawir 3c iyo S2).
Barashada xiriirka qaab-dhismeedka-hawlaha ee Kumamoto amide iyo xeryahooda la xiriira.(a) Qaab dhismeedka iyo habaynta iskudubbaridka.(b) Qiyaasta dhererka xididka geedo jira 7-maalmood oo ka baxa dhexdhexaadka MS oo leh ama aan lahayn 50 μM derivatives coumamonamide.Asterisks waxay muujisaa kala duwanaansho weyn oo ku saabsan daaweynta shaambada (t test, p<0.05).n>18. Xogta waxaa lagu muujiyay celcelis ahaan ± SD.nt macnaheedu waa "lama tijaabin" sababtoo ah in ka badan 50% iniinaha ma soo bixin.(c) Qiyaasta heerka biqilka ee abuurka daweeyay ee lagu beeray 7 maalmood dhexda dhexe ee MS oo leh ama aan lahayn 200 μM coumamonamide iyo xeryahooda la xidhiidha.Asterisks ayaa tilmaamaya kala duwanaansho weyn oo ku saabsan daaweynta shaambada (tijaabada chi-square).n=96.
Waxa xiiso leh, ku darida silsiladaha alkyl ee ka dheer C9 waxay hoos u dhigtay dhaqdhaqaaqa xannibaadda, taas oo soo jeedinaysa in kumamotoic acid xeryahooda la xidhiidha waxay u baahan yihiin silsilado dhinac ah oo cabbir ah si ay u muujiyaan waxqabadkooda bayooloji.
Sababtoo ah falanqeynta xiriirka qaab-dhismeedka-hawlaha ayaa muujisay in C9 loo beddelay ursonic acid iyo ka-soo-saarka nonyloxy ee ursonic acid (oo hadda loo yaqaan KAND 11) ayaa ah kuwa ugu waxtarka badan ee xakameynaya koritaanka dhirta, waxaan sameynay sifo faahfaahsan oo ah KAND 11. Daaweynta Arabidopsis oo leh 50 μM KAND 11 ayaa ku dhawaad si buuxda looga hortagay biqilka, halka uruurinta hoose (40, 30, 20, ama 10 μM) ee KAND 11 ay hakisay koritaanka xididka ee hab ku tiirsan qiyaasta (Jaantus. 4a, b).Si loo tijaabiyo in KAND 11 ay saameynayso jiritaanka meerisemka xididka, waxaan baarnay meerisyada xididka ee leh propidium iodide (PI) oo aan cabbirnay cabbirka meerisemka.Cabbirka meerisemka geedo ku koray meel dhex dhexaad ah oo ka kooban 25 μM KAND-11 waxay ahayd 151.1 ± 32.5 μm, halka cabbirka meerisemka geedo lagu beeray dhexdhexaad kontorool oo ka kooban DMSO uu ahaa 264.7 ± 30.8 μm (Jaantus. 4c, d) , taas oo muujinaysa in KAND-11 ay soo celiso dhaqdhaqaaqa gacanta.faafin.Meerisyada xididka.Iyadoo la raacayo tan, daaweynta KAND 11 waxay hoos u dhigtay qadarka calaamadaynta qaybta unugyada CDKB2; 1p :: CDKB2; 1-GUS calaamada xididka xididka (Jaantus 4e) 17.Natiijooyinkani waxay muujinayaan in KAND 11 ay joojiso koritaanka xididka iyada oo la yareynayo dhaqdhaqaaqa fidinta unugyada.
Falanqaynta saamaynta xakamaynta ee urbenonic acid derivatives (urbenyloxy derivatives) ee koritaanka.(a) Geedo duur-joog ah oo 7-maalmood ah oo ku koray saxannada MS oo leh qiyaasta la tilmaamay ee KAND 11. Bar-cale = 1 cm.(b) Tirada dhererka xididka.Xarfaha waxay muujinayaan kala duwanaansho weyn (Tukey HSD test, p<0.05).n>16. Xogta waxaa lagu muujiyay celcelis ahaan ± SD.(c) Mikroskoobyada konfocal ee propidium iodide-ka leh xididada duurjoogta ah ee ka koray taarikada MS oo leh ama aan lahayn 25 μM KANDQiyaasta bar = 100 µm.(d) Qiyaasta cabbirka meeriska xididka (n = 10 ilaa 11).Kala duwanaanshaha tirakoobka ayaa lagu go'aamiyay iyadoo la adeegsanayo t-tijaabka (p<0.05).Baararka waxay matalaan celceliska cabbirka meerisemka.(e) Farqiga kala duwanaanshaha faragelinta (DIC) microscope ee xididka meerisemka oo ka kooban dhismaha CDKB2;1pro: CDKB2;1-GUS wasakhaysan oo wasakhaysan geedo 5-maalmood jir ah oo ku koray saxannada MS oo leh ama aan lahayn 25 µM KAND assay.
Phytotoxicity ee KAND 11 ayaa lagu sii tijaabiyay iyadoo la adeegsanayo warshad kale oo dicotyledonous ah, tubaakada (Nicotiana tabacum), iyo noolaha qaabka dhirta dhulka ee weyn, beerwort (Marchantia polymorpha).Sida xaaladda Carabidopsis, geedo tubaakada SR-1 oo ku koray dhexdhexaad ka kooban 25 μM KAND 11 ayaa soo saaray xididdo gaaban (Jaantus. 5a).Intaa waxaa dheer, 40 ka mid ah 48 ka mid ah iniinaha ayaa ku soo baxay taargooyin ay ku jiraan 200 μM KAND 11, halka dhammaan 48 ka mid ah iniinaha ay ka soo baxeen warbaahinta si jees jees ah loo daweeyay, taas oo muujinaysa in xaddi sare oo KAND ah ay ahaayeen kuwo muhiim ah (p)<0.05;chi test -square) joojiyey biqilka tubaakada.(Jaantus. 5b).Intaa waxaa dheer, xoojinta KAND 11 ee xakameynaya koritaanka bakteeriyada ee beerka beerka waxay la mid tahay xoojinta waxtarka leh ee Arabidopsis (Jaantus. 5c).Natiijooyinkani waxay muujinayaan in KAND 11 ay joojin karto koritaanka dhirta kala duwan.Waxaan markaa baarnay suurtagalnimada cytotoxicity ee xeryahooda monoamide-ku-xiran ee noolaha kale, kuwaas oo ah unugyada HeLa ee bini'aadamka iyo culeyska Escherichia coli DH5a, sida wakiillada unugyada xayawaanka iyo bakteeriyada sare, siday u kala horreeyaan.Tijaabooyin taxane ah oo kordhinta unugyada, waxaan ku aragnay in coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6, iyo KAND 11 aysan saameyn ku yeelan koritaanka unugyada HeLa ama E. coli ee uruurinta 100 μM (Jaantus. 5d,e).
Joojinta koritaanka KAND 11 ee noolaha aan Carabidopsis-ka ahayn.(a) Geedo tubaakada nooca SR-1 oo laba toddobaad jiray ayaa lagu beeray taargooyin MS oo toosan oo ka kooban 25 μM KAND 11. Taarikada MS oo ka kooban 200 μM KAND 11. (c) Laba toddobaad jir ah nooca duurjoogta ah ee Tak-1 beerka beerka oo ku koray saxannada Gamborg B5 oo leh qiyaasta la tilmaamay ee KAND 11. Fallaadhaha casaanka ah waxay muujinayaan xadhkaha joogsaday koritaannada labada toddobaad gudahood. muddo.(d) Qiimaynta kororka unugyada unugyada HeLa.Tirada unugyada shaqayn kara waxaa lagu cabiray waqti go'an iyadoo la isticmaalayo xirmada tirinta unugyada 8 (Dojindo).Xakameyn ahaan, unugyada HeLa waxaa lagu daaweeyay 5 μg/ml actinomycin D (Xeerka D), kaas oo joojiya qoraalka RNA polymerase oo sababa dhimashada unugyada.Falanqaynta ayaa lagu sameeyay saddex qaybood.(e) E. koliyada baaritaanka unugyada badinta.Kobaca E. coli waxaa lagu falanqeeyay iyadoo la cabiray OD600.Xakameyn ahaan, unugyada waxaa lagu daaweeyay 50 μg/ml ampicillin (Amp), taas oo joojisa isku dhafka gidaarka unugyada bakteeriyada.Falanqaynta ayaa lagu sameeyay saddex qaybood.
Si loo qeexo habka ficil-celinta cytotoxicity ee ay sababtay isku-dhisyada la xidhiidha uramide, waxaanu dib u falanqeynay urbenic acid derivatives oo leh saameyn dhexdhexaad ah oo dhexdhexaad ah.sida ka muuqata sawirka.Sida lagu muujiyey jaantusyada 2b, 6a, geedo ku koray saxannada agar ee ay ku jiraan uruurinta sare (200 μM) ee urmotonic acid 6 waxay soo saartey xididada gaaban iyo kuwa bidix (θ = - 23.7 ± 6.1), halka geedo lagu koray dhexdhexaadiyaha xakamaynta, geedo soo saaray xididdo toosan (θ = - 3.8 ± 7.1).Sifadan korriinka sifada ah waxaa loo yaqaanaa inay ka dhalato cillad la'aanta microtubules cortical14,18.Iyadoo la raacayo helitaankan, daawooyinka microtubule-destabilizing disopyramide iyo oryzalin waxay keeneen xidid isku mid ah oo hoos yimaada xaaladaha koritaankayada (Sawir 2b, 6a).Isla mar ahaantaana, waxaan tijaabinnay urmotonic acid oo aan dooranay dhowr ka mid ah kuwaas oo, xoogaa xoogaa ah, ay keentay korriinka xididka.Isku-dhafka 8, 9, iyo 15 waxay beddeleen jihada koritaanka xididka 75 μM, 50 μM, iyo 40 μM, siday u kala horreeyaan, taas oo muujinaysa in xeryahooda ay si wax ku ool ah u dejin karaan microtubules (Jaantus. 2b, 6a).Waxaan sidoo kale tijaabinay derivative ursolic acid ee ugu awoodda badan, KAND 11, oo ah feejignaan hoose (15 µM) waxaanan ogaanay in codsiga KAND 11 uu xannibay koritaanka xididka iyo in jihada korriinka xididku uu ahaa mid aan sinnayn, in kasta oo ay u janjeeraan dhanka bidix sawirka C3)..Sababtoo ah qiyaasta sare ee dawooyinka yar-yar ee khalkhal geliya mararka qaarkood waxay joojiyaan koritaanka dhirta halkii ay keeni lahaayeen xididada xididada, waxaan markaa qiimeynay suurtogalnimada in KAND 11 ay saameyso microtubules iyadoo la eegayo microtubules cortical ee unugyada epidermal xididka.Immunohistochemistry iyadoo la adeegsanayo unugyada anti-β-tubulin ee unugyada epidermal ee xididada seedling ee lagu daaweeyay 25 μM KAND 11 waxay muujisay luminta ku dhawaad dhammaan microtubules kortikal ee unugyada epidermal ee aagga elongation (Jaantus. 6b).Natiijooyinkani waxay muujinayaan in kumamotonic acid iyo kuwa ka soo jeeda ay u dhaqmaan si toos ah ama si aan toos ahayn microtubules si ay u carqaladeeyaan iyaga iyo in xeryahooda ay yihiin kuwa cusub ee microtubule inhibitors.
Ursonic acid iyo soosaarayaasheeda ayaa beddela microtubules kortikal ee Arabidopsis thaliana.(a) xagasha u janjeerta xididka oo lagu cabiray joogitaanka aashitada urmotonic ee kala duwan ee meelaha la tilmaamay.Saamaynta laba xeryood oo loo yaqaan in ay joojiyaan microtubules: disopyramide iyo oryzalin ayaa sidoo kale la falanqeeyay.Gelitaanka ayaa muujinaya heerka loo isticmaalo in lagu cabbiro xagasha koritaanka xididka.Asterisks waxay muujisaa kala duwanaansho weyn oo ku saabsan daaweynta shaambada (t test, p<0.05).n>19. Baararka miisaanka = 1 cm.(b) Microtubules-ka kortikal ee unugyada epidermal ee aagga dheereynta.Microtubules ee nooca duurjoogta ah ee Arabidopsis Col xididada oo ku koray taarikada MS oo leh ama aan lahayn 25 μM KAND 11 ayaa lagu sawiray midabaynta immunohistochemical iyadoo la adeegsanayo unugyada difaaca aasaasiga ah ee β-tubulin iyo Alexa Fluor-conjugated antibodies.Qiyaasta bar = 10 µm.(c) Qaab dhismeedka mitotic ee microtubules ee xididka meerisemka.Microtubules ayaa la arkay iyadoo la isticmaalayo midabaynta difaaca jirka.Qaab dhismeedka mitirka, oo ay ku jiraan aagagga prophase, spindles, iyo phragmoplasts, ayaa laga soo tiriyey sawirro aan muuqan.Falaadhidu waxay tilmaamayaan qaab-dhismeedka mitirka mitirka.Asterisks waxay muujisaa kala duwanaansho weyn oo ku saabsan daaweynta shaambada (t test, p<0.05).n>9. Baaxadda miisaanka = 50 µm.
Inkasta oo Ursa uu awood u leeyahay inuu carqaladeeyo shaqada microtubule, habka ficilkiisa ayaa la filayaa inuu ka duwan yahay wakiilada depolymerizing microtubule ee caadiga ah.Tusaale ahaan, uruurinta sare ee wakiilada depolymerizing microtubule sida disopyramide iyo oryzalin waxay keenaysaa balaadhinta anisotropic ee unugyada epidermal, halka KAND 11 aanu samayn.Intaa waxaa dheer, wada-codsiga KAND 11 iyo disopyramide waxay keentay jawaab celin korriin xidid ah oo isku-dar ah oo loo yaqaan 'Disopyramide-induced' iyo KAND 11-ku-kordhinta koritaanka ayaa la arkay (Jaantus. S4).Waxaan sidoo kale falanqeynnay jawaabta disopyramide hypersensitive 1-1 (phs1-1) mutant ee KAND 11. phs1-1 waxay leedahay isbeddel aan caadi ahayn oo tubulin kinase ah waxayna soo saartaa xididdo gaaban marka lagu daaweeyo disopyramide9,20.phs1-1 geedo mutant ah oo ku koray agar dhexdhexaad ah oo ay ku jiraan KAND 11 waxay lahaayeen xididdo gaagaaban oo la mid ah kuwa lagu beeray dispyramid (fig. S5).
Intaa waxaa dheer, waxaan aragnay qaab-dhismeedka mitotic microtubule, sida aagagga prophase, spindles, iyo phragmoplasts, ee meerisyada xididka geedo lagu daaweeyay KAND 11. Iyadoo la raacayo indho-indheynta CDKB2; 1p :: CDKB2; 1-GUS, hoos u dhac weyn tirada microtubules mitotic ah ayaa la arkay (Jaantus. 6c).
Si loo caddeeyo cytotoxicity ee KAND 11 ee xallinta unugyada-hoosaadka, waxaan ku daawnay tubaakada BY-2 unugyada ka joojinta KAND 11 waxaanan aragnay jawaabtooda.Waxaan marka hore ku darnay KAND 11 unugyada BY-2 ee muujinaya TagRFP-TUA6, kuwaas oo si fluorescently calaamadeynaya microtubules, si loo qiimeeyo saameynta KAND 11 ee microtubules cortical.Cufnaanta microtubule-ka kortikal ayaa la qiimeeyay iyadoo la adeegsanayo falanqaynta sawirka, taas oo lagu qiyaasay boqolleyda pixels cytoskeletal pixels cytoplasmic.Natiijooyinka imtixaanku waxay muujiyeen in ka dib daaweynta 50 μM ama 100 μM KAND 11 ee saacadda 1, cufnaanta ayaa si weyn hoos ugu dhacday 0.94 ± 0.74% ama 0.23 ± 0.28%, siday u kala horreeyaan, halka cufnaanta unugyada lagu daaweeyay DMSO, ay ahayd 1.0034 ± % (Jaantuska. 7a).Natiijooyinkani waxay la socdaan indho-indheynta Carabidopsis in daaweynta KAND 11 ay keento depolymerization ee microtubules cortical (Jaantus. 6b).Waxaan sidoo kale baarinay khadka BY-2 oo leh GFP-ABD-ku calaamadeeyay actin filaments ka dib markii la daaweeyay isla uruurinta KAND 11 oo aan aragnay in daaweynta KAND 11 ay carqaladeysay fiiloyinka actin.Daaweynta 50 μM ama 100 μM KAND 11 ee 1 h waxay si weyn hoos ugu dhigtay cufnaanta actin filament ilaa 1.20 ± 0.62% ama 0.61 ± 0.26%, siday u kala horreeyaan, halka cufnaanta unugyada DMSO-daaweeyay ay ahayd 1.69 ± 0.51%.7b)Natiijooyinkani waxay ka duwan yihiin saameynta propyzamide, taas oo aan saameyn ku yeelaneynin falcelinta actin, iyo latrunculin B, oo ah actin depolymerizer oo aan saameynaynin microtubules (SI Jaantuska S6).Intaa waxaa dheer, daaweynta coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, ama KAND 11 ma aysan saameynin microtubules ee unugyada HeLa (SI Figure S7).Sidaa darteed, habka ficilka ee KAND 11 ayaa la rumeysan yahay inuu ka duwan yahay kuwa khalkhaliyeyaasha cytoskeleton ee la yaqaan.Intaa waxaa dheer, kormeerkayaga microscopic ee unugyada BY-2 ee lagu daaweeyay KAND 11 ayaa shaaca ka qaaday bilawga dhimashada unugyada inta lagu jiro daaweynta KAND 11 waxayna muujisay in saamiga Evans ee unugyada buluuga ah ee dhintay aysan si weyn u korin ka dib 30 min ee daaweynta KAND 11, halka 90 daqiiqo ka dib daawaynta 50 μM ama 100 μM KAND, tirada unugyada dhintay waxay kordheen 43.7% ama 80.1%, siday u kala horreeyaan (Jaantus. 7c).Isku soo wada duuboo, xogtan ayaa tilmaamaysa in novel ursolic acid derivative KAND 11 uu yahay xannibaadaha cytoskeletal ee u gaarka ah dhirta oo leh hab ficil oo aan hore loo aqoon.
KAND waxay saamaysaa microtubules kortikal, filaha actin, iyo jiritaanka tubaakada BY-2 unugyada.(a) Aragtida microtubules kortikal ee unugyada BY-2 ee joogitaanka TagRFP-TUA6.Unugyada BY-2 ee lagu daweeyay KAND 11 (50 μM ama 100 μM) ama DMSO ayaa lagu baadhay mikroskoob konfocal ah.Cufnaanta microtubule-ka kortikal waxaa laga soo xisaabiyay micrographs ee 25 unugyo madaxbannaan.Xarfaha waxay muujinayaan kala duwanaansho weyn (Tukey HSD test, p<0.05).Qiyaasta bar = 10 µm.(b) Filaments actin cortical ee unugyada BY-2 oo la arkay iyadoo ay jirto GFP-ABD2.Unugyada BY-2 ee lagu daweeyay KAND 11 (50 μM ama 100 μM) ama DMSO ayaa lagu baadhay mikroskoob konfocal ah.Cufnaanta fiilooyinka actin cortical waxaa laga soo xisaabiyay micrographs ee 25 unugyo madaxbannaan.Xarfaha waxay muujinayaan kala duwanaansho weyn (Tukey HSD test, p<0.05).Qiyaasta bar = 10 µm.(c) U fiirsashada unugyada BY-2 dhintay ee Evans buluugUnugyada BY-2 ee lagu daweeyay KAND 11 (50 μM ama 100 μM) ama DMSO ayaa lagu baadhay microscopy-iftiin dhalaalaya.n=3.Qiyaasta bar = 100 µm.
Daah-furka iyo adeegsiga badeecadaha cusub ee dabiiciga ah ayaa horseeday horumar la taaban karo oo laga gaaray dhinacyo kala duwan oo nolosha aadanaha ah, oo ay ku jiraan dawooyinka iyo beeraha.Cilmi-baaris taariikhi ah ayaa la sameeyay si loo helo isku-dhisyo waxtar leh oo laga helo kheyraadka dabiiciga ah.Gaar ahaan, actinomycetes waxaa loo yaqaanaa inay faa'iido u leedahay antiparasitic antiparasitic antiparasitic for nematodes sababtoo ah awoodda ay u leeyihiin inay soo saaraan dheef-shiid kiimikaad sare oo kala duwan sida avermectin, xarunta hogaanka ee ivermectin iyo bleomycin iyo waxyaabaha ka soo baxa, oo loo isticmaalo dawo ahaan sida wakiilka anticancer21,22.Sidoo kale, xeryahooda kala duwan ee herbicidal ayaa laga helay actinomycetes, kuwaas oo qaarkood horeba ganacsi ahaan loo isticmaalay1,23.Sidaa daraadeed, falanqaynta dheef-shiid kiimikaadka actinomycete si loo go'doomiyo alaabada dabiiciga ah ee leh waxqabadyada bayoolojiga ee la rabo ayaa loo tixgeliyaa istaraatiijiyad wax ku ool ah.Daraasaddan, waxaan ku helnay xarun cusub, coumamonamide, oo ka timid S. werraensis oo si guul leh u farsameynay.Ursonic acid waa dhexda u dhexaysa urbenamide iyo ka-soo-saarkeeda.Waxay sababi kartaa qallooca xididka sifada leh, waxay muujisaa firfircooni dhexdhexaad ah ama xoog leh oo herbicidal ah, waxayna si toos ah ama si dadban u dhaawacaysaa microtubules dhirta.Si kastaba ha ahaatee, habka ficilka ee urmotonic acid ayaa laga yaabaa inuu ka duwan yahay kuwa xakameynaya microtubule ee hadda jira, maadaama KAND 11 ay sidoo kale carqaladeyso fal-celinta actin oo ay keento dhimashada unugyada, taas oo soo jeedinaysa habka nidaaminta kaas oo urmotonic acid iyo ka-soo-saarkeedu ay saameyn ku yeeshaan qaabab badan oo cytoskeletal ah..
Tilmaamaha faahfaahsan ee urbenonic acid waxay kaa caawin doontaa inaad si fiican u fahamto habka ficilka urbenonic acid.Gaar ahaan, yoolka soo socda waa in la qiimeeyo awoodda ursonic acid si ay ugu xidho microtubules hoos u dhaca si loo go'aamiyo in ursonic acid iyo derivatives ay si toos ah ugu dhaqmaan microtubules iyo depolymerize iyaga, ama haddii ay ficilkooda natiijada destabilization microtubule.Intaa waxaa dheer, haddii ay dhacdo in microtubules aysan ahayn bartilmaameed toos ah, aqoonsiga goobta ficilka iyo bartilmaameedyada molecular ee ursonic acid ee unugyada dhirta ayaa gacan ka geysan doonta in la sii fahmo sifooyinka xeryahooda la xidhiidha iyo siyaabaha suurtagalka ah ee lagu hagaajinayo dhaqdhaqaaqa dhirta.Qiimayntayada bioactivity ayaa shaaca ka qaaday awoodda cytotoxic ee gaarka ah ee ursonic acid ee koritaanka dhirta sida Arabidopsis thaliana, tubaakada iyo beerka beerka, halka E. coli iyo unugyada HeLa midna aysan saameynin.Wax yar ama aan lahayn sunta unugyada xayawaanka ayaa faa'iido u leh derivatives ursonic acid haddii loo sameeyo herbicides si loogu isticmaalo beeraha furan.Runtii, maadaama microtubules ay yihiin qaab-dhismeedyo caadi ah oo ku jira eukaryotes, ka-hortagga xulashada dhirta ayaa ah shuruud muhiim ah oo loogu talagalay herbicides.Tusaale ahaan, propyzamide, wakiilka depolymerizing microtubule kaas oo si toos ah ugu xidha tubulin oo joojiya polymerization, ayaa loo isticmaalaa sidii geedo yaryar sababtoo ah sunta hoose ee unugyada xayawaanka24.Si ka duwan disopyramide, benzamides ee la xidhiidha waxay leeyihiin tilmaamo bartilmaameed oo kala duwan.Marka lagu daro microtubules dhirta, RH-4032 ama benzoxamide waxay sidoo kale joojisaa microtubules unugyada xayawaanka ama oomycetes, siday u kala horreeyaan, iyo zalilamide waxaa loo isticmaalaa fungicide sababtoo ah phytotoxicity25,26,27 hooseeya.Beerta cusub ee la helay iyo ka-soo-saarkeedu waxay soo bandhigaan cytotoxicity-doorasho oo ka dhan ah dhirta, laakiin waxaa xusid mudan in wax-ka-beddello dheeraad ah laga yaabo inay beddelaan bartilmaameedkooda gaarka ah, oo laga yaabo inay bixiyaan noocyo dheeraad ah oo loogu talagalay xakamaynta fangaska pathogenic ama oomycetes.
Astaamaha gaarka ah ee urbenonic acid iyo waxyaabaha ka soo baxa ayaa faa'iido u leh horumarkooda sida herbicides waxayna u isticmaalaan qalab cilmi baaris ah.Muhiimadda cytoskeleton ee xakamaynta qaabka unugyada dhirta ayaa si weyn loo aqoonsan yahay.Daraasado hore ayaa muujiyay in dhirtu ay horumarisay habab adag oo ah ururka microtubule cortical iyadoo la xakameynayo dhaqdhaqaaqa microtubule si sax ah loo xakameeyo morphogenesis.Tiro badan oo unugyo ah oo mas'uul ka ah nidaaminta dhaqdhaqaaqa microtubule ayaa la aqoonsaday, cilmi-baaris la xiriirta ayaa wali socota3,4,28.Fahamkayaga hadda ee dhaqdhaqaaqa microtubule ee unugyada dhirta si buuxda uma sharaxin hababka ururinta microtubule cortical.Tusaale ahaan, inkastoo labadaba disopyramide iyo oryzalin labaduba ay depolymerize microtubules, disopyramide waxay sababtaa qallooc xidid oo daran halka oryzalin uu leeyahay saameyn khafiif ah.Waxaa intaa dheer, isbeddellada ku jira tubulin, taas oo dejisa microtubules, waxay sidoo kale keentaa dextrorotation ee xididdada, halka paclitaxel, oo sidoo kale dejisa dhaqdhaqaaqa microtubule, ma aha.Sidaa darteed, daraasadda iyo aqoonsiga bartilmaameedyada molecular ee ursolic acid waa inay bixiyaan fikrado cusub oo ku saabsan nidaaminta microtubules cortical dhirta.Sidoo kale, isbarbardhigga mustaqbalka ee kiimikooyinka waxtarka u leh kor u qaadida korriinka qalloocan, sida disopyramide, iyo kiimikooyinka waxtarka yar, sida oryzalin ama kumamotoric acid, ayaa bixin doona tilmaamo ku saabsan sida koritaanka qalloocan uu u dhaco.
Dhanka kale, dib-u-habaynta cytoskeletal ee la xidhiidha difaaca ayaa ah suurtagal kale oo lagu sharxi karo cytotoxicity ee ursonic acid.Infekshanka cudur-sidaha ama soo-gelinta elicitor ee unugyada dhirta ayaa mararka qaarkood sababa burbur ku yimaada cytoskeleton iyo dhimashada unugyada ku xiga29.Tusaale ahaan, oomycete-derived cryptoxanthin ayaa lagu soo warramey inay carqaladeyso microtubules iyo actin filaments ka hor dhimashada unugga tubaakada, oo la mid ah waxa ku dhaca daaweynta KAND30,31.Isku ekaanshaha u dhexeeya jawaabaha difaaca iyo jawaabaha gacanta ee ay keentay ursonic acid ayaa noo horseeday in aan qiyaasno in ay kicinayaan hababka gacanta ee caadiga ah, in kasta oo ay ka caddahay saameynta ursonic acid ee ka dhaqso badan oo ka xoog badan cryptoxanthin.Si kastaba ha noqotee, cilmi-baaristu waxay muujisay in carqaladaynta fiilooyinka actin ay kor u qaaddo dhimashada unugyada lama filaanka ah, taas oo aan had iyo jeer la socon microtubule disruption29.Intaa waxaa dheer, waa la arki doonaa in cudur-sidaha ama elicitor-ka uu keeno koritaanka xididka qalloocan, sida ka-soo-baxyada ursonic acid ay sameeyaan.Haddaba, aqoonta molecular ee isku xidhaysa jawaabaha difaaca iyo cytoskeleton waa dhibaato soo jiidasho leh oo wax laga qabanayo.Ka faa'iidaysiga joogitaanka xeryahooda miisaanka kelli ee hooseeya ee la xidhiidha ursonic acid, iyo sidoo kale noocyo kala duwan oo asal ah oo leh awoodo kala duwan, waxay bixin karaan fursado lagu beegsado hababka gacanta ee aan la garanayn.
Isku soo wada duuboo, helitaanka iyo adeegsiga xeryahooda cusub ee wax ka beddelaya dhaqdhaqaaqa microtubule ayaa bixin doona habab awood leh si wax looga qabto hababka molecular ee kakan ee salka ku haya go'aaminta qaabka unugyada dhirta.Xaaladdan oo kale, urmotonic acid ee dhowaan la sameeyay, taas oo saameynaysa microtubules iyo filaha actin oo keena dhimashada unugyada, ayaa laga yaabaa inay bixiso fursad lagu xalliyo xiriirka ka dhexeeya xakamaynta microtubule iyo hababkan kale.Markaa, falanqaynta kiimikaad iyo bayooloji iyadoo la adeegsanayo urbenonic acid waxay naga caawin doontaa inaan fahanno hababka nidaaminta unugyada ee xakameynaya cytoskeleton-ka dhirta.
Inoculate S. werraensis MK493-CF1 geli 500 mL qasnadda Erlenmeyer oo ka kooban 110 mL oo dhexdhexaad ah abuur ka kooban 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) koollada nuxurka, 1% ( w/v) Halabuurka Bacto .-soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w / v) soosaar galleyda (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w / v) (NH4) 2SO4 iyo 0.2% CaCO3 ee biyaha deionized.(pH 7.4 ka hor inta aan la nadiifin).Dhaqamada abuurka waxaa lagu duray ruxul wareeg ah (180 rpm) at 27°C muddo 2 maalmood ah.Beerista wax soo saarka iyada oo loo marayo halsano dawlad adag.Dhaqanka abuurka (7 ml) ayaa lagu wareejiyay 500 ml K-1 galaas oo ka kooban 40 g oo dhexdhexaad ah oo wax soo saar ah oo ka kooban 15 g oo shaciir ah (MUSO Co., Ltd., Japan) iyo 25 g oo biyo deionized ah (pH aan la hagaajin. jeermiska ka hor) .).Halsano waxaa lagu sameeyay 30 ° C mugdiga 14 maalmood.Walxaha halsano waxaa lagu soo saaray 40 ml/ dhalo EtOH iyo centrifuged (1500 g, 4°C, 10 min).Dhaqan ka sarreeya (60 ml) ayaa lagu soo saaray isku dar ah 10% MeOH/EtOAc.Lakabka dabiiciga ah waxaa lagu soo saaray cadaadis la dhimay si loo helo hadhaaga (59.5 mg), kaas oo lagu sakhiray HPLC oo leh elution gradient (0-10 daqiiqo: 90%) ee tiirka wejiga gadaasha (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID). 10 mm × dhererka 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 daqiiqo: 90% H2O/CH3CN ilaa 70% H2O/CH3CN (gradient), 35–45 daqiiqo: 90% H2O/EtOH, 45–155 daqiiqo: 90% H2O / EtOH ilaa 100% EtOH (gradient (gradient), 155-200 min: 100% EtOH) ee heerka socodka 1.5 ml / min, coumamonamide (1, 36.0 mg) ayaa la go'doomiyay sida budada amorphous cad.
Kumamotoamide (1);1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H).), 4.08 (s, 3H);13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3;ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ qiimaha la xisaabiyay: 141.0659, qiimaha la qiyaasay: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593-153 cm
Abuurka Columbia (Col-0) ayaa laga helay Xarunta Kheyraadka Nafleyda ee Arabidopsis (ABRC) iyadoo loo fasaxay isticmaalka cilmi-baarista.Abuurka Col-0 waa la faafiyay oo lagu ilaalinayay xaaladahayada shaybaarka waxaana loo adeegsaday dhirta Carabta nooca duurjoogta ah.Abuurka Arabidopsis waa la nadiifiyey oo lagu beeray xoog badhkii Murashige iyo Skoog dhexdhexaad ah oo ka kooban 2% sukrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2- (4-morpholino) ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Kiimiko saafi ah ).) iyo 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, at 23 °C iyo iftiin joogto ah.Abuurka phs1-1 mutant waxaa bixiyay T. Hashimoto (Machadka Sayniska iyo Farsamada ee Nara).
Abuurka cadaadiska SR-1 waxaa bixiyay T. Hashimoto (Machadka Sayniska iyo Tignoolajiyada ee Nara) waxaana loo adeegsaday sida dhirta tubaakada duurjoogta ah.Abuurka tubaakada ayaa la nadiifiyey oogada oo lagu qooyay biyo nadiif ah saddex habeen si kor loogu qaado biqilka, ka dibna la geliyey xal nus ka kooban 2% sukrose, 0.05% (w/v) MES, iyo 0.8% gellan xanjo (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murshige.iyo Skoog dhexdhexaad ah) oo leh pH 5.7 oo lagu beeray 23°C hoos iftiin joogto ah.
Cadaadiska Tak-1 waxaa bixiyay T. Kohchi (Jaamacadda Kyoto) waxaana loo isticmaalay sidii cutubka tijaabada ah ee caadiga ah ee daraasadda beerka.Gemma waxaa laga soo qaatay dhirta la dhaqay oo la jeermis-diray ka dibna lagu dhejiyay Gamborg B5 dhexdhexaad ah (Fujifilm Wako Pure Chemical) oo ka kooban 1% sukrose iyo 0.3% xabagta gelan waxaana lagu dhex beeray 23°C hoos iftiin joogto ah.
Unugyada tubaakada BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Jaallaha dhalaalaya 2) waxaa bixiyay S. Hasezawa (Jaamacadda Tokyo).Unugyada BY-2 ayaa lagu qasi jiray 95-laab oo lagu beddelay Linsmeier iyo Skoog dhexdhexaad ah oo toddobaadle lagu kabay 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32.Ka joojinta unugga ayaa lagu qasay ruxul wareeg ah 130 rpm at 27°C gudcurka.Ku dhaq unugyada 10 jeer mugga dhexdhexaadka cusub oo dib ugu celi isla dhexdhexaadinta.Khadadka unugyada transgenic ee BY-2 oo si adag u muujinaya sumadeeyaha microtubule TagRFP-TUA6 ama calaamadeeyaha actin filament GFP-ABD2 ee hoos yimaada fayraska mosaic ee cauliflower 35S ayaa la soo saaray sida lagu sharaxay33,34,35.Xadadkan unugyada waa la ilaalin karaa oo waa la is waafajin karaa iyadoo la isticmaalayo habab la mid ah kuwa loo isticmaalo xariiqda unugyada BY-2 ee asalka ah.
Unugyada HeLa waxaa lagu beeray Dulbecco's waxka bedelka Eagle's dhexdhexaad (DMEM) (Technology Life) oo lagu kabay 10% serum bovine ee uurjiifka, 1.2 U/ml penicillin, iyo 1.2 μg/ml streptomycin oo ku jirta 37°C incubator leh 5% CO2.
Dhammaan tijaabooyinka lagu sifeeyay qoraal-gacmeedkan waxaa la sameeyay si waafaqsan xeerarka iyo xeerarka badbaadada noolaha ee Jabbaan.
Isku-dhafka ayaa lagu milmay dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) sida xalalka saamiyada waxaana lagu qasi jiray dhexdhexaadka MS ee Carabidopsis iyo tubaakada ama Gamborg B5 dhexdhexaad ah beerka.Qiimaynta ka hortagga koritaanka xididka, in ka badan 10 iniin ka mid ah saxankiiba ayaa lagu beeray dhexdhexaad agar oo ay ku jiraan xeryahooda la tilmaamay ama DMSO.Seeds waxaa lagu dhex beeray qolka koritaanka muddo 7 maalmood ah.Geedo ayaa la sawiray waxaana la qiyaasay dhererka xididdada.Qiimaynta biqilka Arabidopsis, 48 iniin ah saxankiiba ayaa lagu beeray dhexdhexaad agar oo ka kooban 200 μM ama DMSO.Abuurka Carabidopsis ayaa lagu koray qolka koritaanka iyo tirada geedo biqilka ah ayaa la tiriyay 7 maalmood ka dib biqilka (dag).Si loo qiimeeyo biqilka tubaakada, 24 iniin ah saxankiiba ayaa lagu beeray dhexdhexaad agar oo ka kooban 200 μM KAND ama DMSO.Iniinaha tubaakada ayaa lagu beeray qol korriin iyo tirada geedo biqil ah ayaa la tiriyay 14 maalmood ka dib.Qiyaasta xakamaynta koritaanka beerka, 9 embriyaha ee saxan kasta ayaa lagu dhejiyay dhexdhexaad dhexdhexaad ah oo ay ku jiraan qiyaasta la tilmaamay ee KAND ama DMSO waxaana lagu dhajiyay qolka koritaanka 14 maalmood.
Isticmaal geedo leh 5 mg/ml propidium iodide (PI) si aad u aragto ururka xididka meerisemka.Astaamaha PI waxaa lagu arkay microscopy fluorescence iyadoo la adeegsanayo mikroskoob-ka is-kaanka leysarka ee TCS SPE confocal (Leica Microsystems).
Midabaynta histochemical ee xididada leh β-glucuronidase (GUS) ayaa la sameeyay iyadoo la raacayo nidaamka ay ku sifeeyeen Malami iyo Benfey36.Seedlings waxaa lagu hagaajiyay 90% acetone habeenkii, oo lagu dhejiyay 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid ee GUS kaydinta 1 saac waxaana lagu dhejiyay xal chloraldehyde fuuqbaxay.(8 g koloriin hydrate, 2 ml oo biyo ah iyo 1 ml glycerol) oo lagu arkay faragelin kala duwanaansho microscopy iyadoo la adeegsanayo mikroskoob Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Xaglaha xididka ayaa lagu cabbiray geedo jira 7-maalmood oo ku koray taarikada toosan.Ka cabbir xagasha xididka jihada vector-ka cufisjiidad sida lagu qeexay talaabada 6.
Habaynta microtubules-ka kortikal ayaa la arkay sida lagu sharraxay, iyada oo wax laga beddelayo hab-raaca 37.Anti-β-tubulin antibody (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) iyo Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) ayaa loo isticmaalay sidii unugyada aasaasiga ah iyo kuwa sare ee 1: 1000 iyo 1: 100 dilutions, siday u kala horreeyaan.Sawirada fluorescence ayaa lagu helay iyadoo la adeegsanayo mikroskoob-ka-sharaf leysarka ee TCS SPE (Leica Microsystems).Hel sawirada Z-stack oo samee saadaalinta xoojinta ugu badan sida waafaqsan tilmaamaha soo saaraha.
Baaritaanka faafinta unugyada HeLa waxaa lagu sameeyay iyadoo la isticmaalayo Qalabka Tirinta Unugyada 8 (Dojindo) sida waafaqsan tilmaamaha soo saaraha.
Kobaca E. coli DH5a waxaa lagu falanqeeyay iyadoo lagu cabiray cufnaanta unugga ee dhaqanka iyadoo la adeegsanayo spectrophotometer 600 nm (OD600).
Ururka cytoskeletal ee unugyada transgenic BY-2 ayaa lagu arkay iyadoo la adeegsanayo mikroskoob fluorescence ah oo ku qalabaysan CSU-X1 qalab iskaanka confocal (Yokogawa) iyo kamarad sCMOS ah (Zyla, Andor Technology).Cufnaanta cytoskeletal waxaa lagu qiimeeyay falanqaynta sawirka, taas oo qiyaastay boqolleyda pixels cytoskeletal ee pixels cytoplasmic ee sawirada confocal iyadoo la adeegsanayo software ImageJ sida lagu tilmaamay38,39.
Si loo ogaado dhimashada unugga ee unugyada BY-2, qayb ka mid ah ka joojinta unugga ayaa lagu darey 0.05% Evans buluug 10 daqiiqo heerkulka qolka.Midabaynta buluuga ah ee Evans ee unugyada dhintay waxay kuxirantahay ka-baxa dheeha unugyada shaqayn kara ee xuubabka balasmaha40.Unugyada wasakhaysan ayaa lagu arkay iyadoo la isticmaalayo mikroskoob-joog ah oo dhalaalaya (BX53, Olympus).
Unugyada HeLa waxaa lagu koray DMEM oo lagu kabay 10% FBS oo ku dhexjiro qoyaan leh 37°C iyo 5% CO2.Unugyada waxaa lagu daaweeyay 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), ama 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) 6 h at 37°C.Unugyada waxaa lagu hagaajiyay MetOH 10 daqiiqo ka dibna acetate 5 min heerkulka qolka.Unugyada go'an ayaa lagu daray β-tubulin antibody aasaasiga ah (1D4A4, Proteintech: 66240-1) oo lagu qasi jiray 0.5% BSA/PBS muddo 2 saacadood ah, waxaana lagu dhaqay 3 jeer TBST, ka dibna waxaa lagu daray Alexa Fluor antibody.488 1 saac.- Mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) iyo 15 ng/ml 4′,6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) oo lagu qasi jiray 0.5% BSA/PBS.Ka dib markii lagu maydhay TBST saddex jeer, unugyo wasakhaysan ayaa lagu arkay muraayadda Nikon Eclipse Ti-E oo rogan.Sawirada waxaa lagu qabtay kamarad la qaboojiyey ee Hamamatsu ORCA-R2 CCD iyadoo la isticmaalayo barnaamijka MetaMorph (Aaladaha Molecular).
Waqtiga boostada: Juun-17-2024