Waad ku mahadsan tahay booqashada Nature.com. Nooca biraawsarka aad isticmaaleyso wuxuu leeyahay taageero CSS oo xaddidan. Natiijooyinka ugu fiican, waxaan kugula talineynaa inaad isticmaasho nooc cusub oo biraawsarkaaga ah (ama aad joojiso Habka La-qabsiga ee Internet Explorer). Dhanka kale, si loo hubiyo taageerada socota, waxaan soo bandhigaynaa goobta iyada oo aan la isticmaalin qaabeyn ama JavaScript.
Helitaanka iyo isticmaalka faa'iidada leh ee alaabada dabiiciga ah waxay gacan ka geysan kartaa hagaajinta nolosha aadanaha. Kiimikooyinka joojiya koritaanka dhirta ayaa si weyn loogu isticmaalaa sidii sunta cayayaanka si loo xakameeyo haramaha. Maadaama loo baahan yahay in la isticmaalo noocyo kala duwan oo sunta cayayaanka ah, waxaa loo baahan yahay in la aqoonsado isku-dhafka leh habab cusub oo wax-qabad ah. Daraasaddan, waxaan ku ogaanay isku-darka cusub ee N-alkoxypyrrole, coumamonamide, oo ka yimid Streptomyces werraensis MK493-CF1 waxaanan aasaasnay habka isku-darka oo dhammaystiran. Iyada oo loo marayo tijaabooyinka dhaqdhaqaaqa bayoolojiga, waxaan ogaanay in urs-monoamic acid uu yahay dhexdhexaad macmal ah oo urs-monoamide ah iyo awood.Horumarka dhirta oo joojiyaIntaa waxaa dheer, waxaan soo saarnay noocyo kala duwan oo ah noocyada urbenonic acid derivatives, oo ay ku jiraan urbenyloxy derivatives (UDA), kaas oo leh firfircooni sare oo disha dhirta iyada oo aan si xun u saameyn koritaanka unugyada HeLa. Waxaan sidoo kale ogaanay in noocyada urmotonic acid derivatives ay carqaladeeyaan microtubules-ka dhirta; marka lagu daro, KAND waxay saameysaa fiilooyinka actin waxayna kicisaa dhimashada unugyada; Saamayntan badan ee kala duwan waxay ka duwan tahay kuwa ka hortagga microtubule ee la yaqaan waxayna soo jeedinayaan farsamo cusub oo ficil loogu sameeyo ursonic acid, taas oo matalaysa faa'iido muhiim ah oo ku jirta horumarinta geedaha cusub ee geedaha lagu buufiyo.
Helitaanka iyo adeegsiga wax ku oolka ah ee alaabada dabiiciga ah ee faa'iidada leh iyo waxyaabaha ka soo baxa waa hab lagu hagaajinayo tayada nolosha aadanaha. Dheef-shiid kiimikaadka labaad ee ay soo saaraan noolaha yaryar, dhirta iyo cayayaanka ayaa horseeday horumar weyn oo ku yimid daawada iyo beeraha. Antibiyootiko badan iyo daawooyin ka hortagga leukemia ayaa laga sameeyay alaabada dabiiciga ah. Intaa waxaa dheer, noocyo kala duwan oosunta cayayaanka, fungicides iyo herbicides ayaa laga soo saaraa alaabadan dabiiciga ah si loogu isticmaalo beeraha. Gaar ahaan, herbicides-ka xakamaynta haramaha waa qalab muhiim ah oo lagu kordhinayo wax soo saarka dalagyada beeraha casriga ah, noocyo kala duwan oo iskudhis ahna horey ayaa loogu isticmaalay ganacsi ahaan. Dhowr geeddi-socod oo unugyo ah oo ku jira dhirta, sida sawir-qaadista, dheef-shiid kiimikaadka amino acid, isku-darka derbiga unugyada, nidaaminta mitosis, calaamadaynta phytohormone, ama isku-darka borotiinka, ayaa loo arkaa bartilmaameedyo caadi ah oo herbicides ah. Iskudhisyada joojiya shaqada microtubule waa nooc caadi ah oo herbicides ah oo saameeya koritaanka dhirta iyagoo saameeya xeerka mitotic2.
Microtubules waa qaybo ka mid ah cytoskeleton-ka waxaana si weyn loogu kaydiyaa unugyada eukaryotic-ga. Tubulin heterodimer wuxuu ka kooban yahay α-tubulin iyo β-tubulin oo sameeya protofilaments microtubule toosan, iyadoo 13 protofilaments ay sameeyaan qaab dhismeed dhululubo ah. Microtubules-ku waxay doorar badan ka ciyaaraan unugyada dhirta, oo ay ku jiraan go'aaminta qaabka unugyada, qaybinta unugyada, iyo gaadiidka gudaha unugyada3,4. Unugyada dhirta waxay ka kooban yihiin microtubules oo ka hooseeya xuubka balaasmaha ee interphase, waxaana loo maleynayaa in microtubules-kan loo yaqaan cortical-ka ay xakameeyaan abaabulka microfibrils-ka cellulose iyada oo loo marayo nidaaminta isku-dhafka cellulose synthase4,5. Microtubules-ka cortical-ka ee unugyada epidermal-ka xididka, oo ku yaal aagga fidinta degdegga ah ee caaradda xididka, waxay ku yaalliin dhinaca dambe, microfiber-yada cellulose-na waxay raacaan microtubules-kan waxayna xaddidaan jihada ballaarinta unugyada, taasoo kor u qaadaysa fidinta unugyada anisotropic. Sidaa darteed, shaqada microtubule waxay si dhow ula xiriirtaa qaab-dhismeedka dhirta. Beddelka amino acid ee hiddo-sidayaasha ku jira tubulin waxay sababaan qalooc ka mid ah silsiladaha microtubule-ka cortical iyo koritaanka bidix ama midig ee Arabidopsis 6,7. Sidoo kale, isbeddellada ku yimaada borotiinnada la xiriira microtubule ee nidaamiya dhaqdhaqaaqa microtubule waxay sidoo kale horseedi karaan koritaanka xididka oo qalloocan8,9,10,11,12,13. Intaa waxaa dheer, daaweynta geedaha yaryar ee carqaladeeya microtubule sida disopyramide, oo sidoo kale loo yaqaan pretilachlor, ayaa sidoo kale sababa koritaanka xididka bidix ee qalloocan14. Xogtani waxay muujinaysaa in nidaaminta saxda ah ee shaqada microtubule ay muhiim u tahay go'aaminta jihada koritaanka dhirta.
Noocyo kala duwan oo ka mid ah daawooyinka microtubule ayaa la helay, daawooyinkanina waxay gacan weyn ka geysteen cilmi-baarista cytoskeletal, iyo sidoo kale beeraha iyo daawada2. Gaar ahaan, oryzalin, isku-dhafka dinitroaniline, disopyramide, isku-dhafka la xiriira benzamide, iyo analogues-kooda ayaa xannibi kara shaqada microtubule sidaas darteedna joojin kara koritaanka dhirta. Sidaa darteed, waxaa si weyn loogu isticmaalaa sidii cayayaanka lagu dilo geedaha. Si kastaba ha ahaatee, maadaama microtubules ay yihiin qayb muhiim ah oo ka mid ah unugyada dhirta iyo xayawaanka, inta badan daawooyinka microtubule waxay sun u yihiin labada nooc ee unugyada. Sidaa darteed, inkastoo ay u adeegsadaan sidii cayayaanka lagu dilo geedaha, tiro kooban oo ah wakiilada antimicrotubule ayaa loo isticmaalaa ujeedooyin wax ku ool ah.
Streptomyces waa nooc ka mid ah qoyska Streptomyces, oo ay ku jiraan bakteeriyada aerobic, gram-positive, iyo filamentous waxaana si weyn loogu yaqaanaa awooddeeda ay ku soo saarto noocyo badan oo metabolites labaad ah. Sidaa darteed, waxaa loo arkaa mid ka mid ah ilaha ugu muhiimsan ee alaabada dabiiciga ah ee cusub ee firfircoon ee bayoloji ahaan. Daraasadda hadda socota, waxaan ku ogaanay isku-darka cusub ee loo yaqaan coumamonamide, kaas oo laga soocay Streptomyces werraensis MK493-CF1 iyo S. werraensis ISP 5486. Iyadoo la adeegsanayo falanqaynta spectral iyo falanqaynta spectral oo dhammaystiran, qaab-dhismeedka coumamonamide ayaa la aqoonsaday waxaana la go'aamiyay qalfoofkiisa gaarka ah ee N-alkoxypyrrole. synthesis. Ursmonic acid, oo ah dhexdhexaad macmal ah oo ursmonoamide iyo waxyaabaha ka soo baxa, ayaa la ogaaday inay joojiso koritaanka iyo biqilka geedka caanka ah ee Arabidopsis thaliana. Daraasad xiriir qaab-dhismeed-hawleed, waxaan ku ogaanay in isku-darka C9 oo loo beddelay ursonic acid, oo loo yaqaan nonyloxy derivative of ursonic acid (KAND), uu si weyn u wanaajiyo saameynta xakamaynta ee koritaanka iyo biqilka. Waxaa xusid mudan, daawada cusub ee laga helay koritaanka dhirta ayaa sidoo kale saameysay koritaanka tubaakada iyo beerkawort mana ahayn sun ku ah bakteeriyada ama unugyada HeLa. Intaa waxaa dheer, qaar ka mid ah noocyada ka soo jeeda asiidhka urmotonic waxay keenaan nooc xidid oo qalloocan, taasoo tilmaamaysa in kuwa ka soo jeeda asiidhka urmotonic ay si toos ah ama si dadban u saameeyaan microtubules. Iyadoo la raacayo fikraddan, indha-indheynteena microtubules ee lagu calaamadeeyay immunohistochemically ama borotiinno fluorescent ah waxay muujinayaan in daaweynta KAND ay ka saarto microtubules. Intaa waxaa dheer, daaweynta laga soo xigtay kumamotonic acid waxay carqaladeysaa microfilaments actin. Sidaa darteed, waxaan helnay daawo cusub oo ka hortagta koritaanka dhirta oo farsamo gaar ah oo ficilkeedu ku lug leeyahay burburinta cytoskeleton.
Xashiishadda MK493-CF1 waxaa laga soocay ciidda Shinagawa-ku, Tokyo. Xashiishadda MK493-CF1 waxay samaysay mycelium stromal oo si fiican u laansan. Taxanaha qayb ahaan ee hidda-wadaha RNA ee 16S ribosomal (1422 bp) ayaa la go'aamiyay. Xashiishaddani aad bay ugu egtahay S. werraensis (NBRC 13404T = ISP 5486, 1421/1422 bp, T: nooca caadiga ah, 99.93%). Iyada oo ku saleysan natiijadan, waxaa la go'aamiyay in noocani uu si dhow ula xiriiray nooca nooca S. werraensis. Sidaa darteed, waxaan si ku meel gaar ah ugu magac darnay noocaan S. werraensis MK493-CF1. S. werraensis ISP 5486T sidoo kale waxay soo saartaa isku-dhisyo firfircoon oo isku mid ah. Maadaama aysan jirin cilmi-baaris hore oo lagu sameeyay helitaanka alaabada dabiiciga ah ee ka imanaya noolahaan yar yar, cilmi-baaris kiimiko oo dheeraad ah ayaa la sameeyay. Ka dib markii lagu beeray S. werraensis MK493-CF1 meel dhexe oo shaciir ah iyadoo la isticmaalayo halsano adag heerkul ah 30°C muddo 14 maalmood ah, waxaa laga soo saaray 50% EtOH. 60 ml oo muunad ah ayaa la qalajiyey si loo helo 59.5 mg oo ah soosaar cayriin ah. Soosaarka cayriin waxaa lagu sameeyay HPLC marxaladda dambe si loo siiyo N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide (1, oo loogu magac daray coumamonamide, 36.0 mg). Wadarta guud ee 1 waa qiyaastii 60% soosaarka cayriin. Sidaa darteed, waxaan go'aansanay inaan si faahfaahsan u baranno sifooyinka kumamotoamide 1.
Coumamonamide 1 waa budo cad oo aan qaab lahayn iyo spectrometry cufnaan sare leh (HRESIMS) waxay xaqiijinaysaa C6H8N2O2 (Jaantuska 1). Jajabka pyrrole ee C2-ku beddelay ee isku-dhafkan waxaa lagu gartaa δH 6.94 (1H, t, J = 2.8, 4.8 Hz, H-4), δH 6.78 (1H, d, J = 2.5, δH ee 1H NMR spectrum: 4.5 Hz, H-5) iyo δH 6.78 (1H, d, J = 2.5 Hz, H-6), spectrum-ka 13C NMR wuxuu muujinayaa jiritaanka afar atom oo kaarboon sp2 ah. Joogitaanka koox amide ah oo ku taal booska C2 waxaa lagu qiimeeyay isku xidhka HMBC laga bilaabo proton-ka C-3 ilaa kaarboon carbonyl amide ee δC 161.1. Intaa waxaa dheer, 1 H iyo 13 C NMR waxay ugu sarreeyaan δH 4.10 (3H, S) iyo δC 68.3 waxay muujinayaan joogitaanka kooxaha N-methoxy ee molecule-ka. Inkasta oo booska saxda ah ee kooxda methoxy aan weli la go'aamin iyadoo la adeegsanayo falanqaynta spectroscopic sida enhanced difference spectroscopy iyo soo gaabinta nukliyeerka Overhauser (NOEDF), N-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxamide wuxuu noqday isku-darka ugu horreeya ee musharraxa.
Si loo go'aamiyo qaab-dhismeedka saxda ah ee 1, isku-darka guud ayaa la sameeyay (Jaantuska 2a). Daaweynta 2-aminopyridine 2 ee ganacsi ahaan la heli karo oo leh m-CPBA waxay keentay N-oxide 3 oo u dhiganta wax-soo-saarka tirada. Ka dib 2-aminoazidation ee 2, falcelinta cyclocondensation ee uu sharraxay Abramovich waxaa lagu sameeyay benzene 90°C si loo helo 1-hydroxy-1H-pyrrole-2-carbonitrile 5 garaam. Xawaaraha 60% (laba marxaladood). 15,16. Methylation iyo hydrolysis ee 4 ka dibna waxay bixiyeen 1-methoxy-1H-pyrrole-2-carboxylic acid (oo loo yaqaan "cumotonic acid", 6) oo ah wax-soo-saar wanaagsan (70%, laba tallaabo). Ugu dambeyntii, amidation via acid chloride intermediate 6 iyadoo la isticmaalayo ammonia aqueous ayaa siisay Kumamoto amide 1 oo ah wax-soo-saar 98%. Dhammaan xogta muuqaalka ee 1 ee la sameeyay waxay la mid ahaayeen 1 go'doonsan, sidaa darteed qaab-dhismeedka 1 ayaa la go'aamiyay;
Isku-darka guud iyo falanqaynta dhaqdhaqaaqa bayoolojiga ee urbenamide iyo urbenic acid. (a) Isku-darka guud ee Kumamoto amide. (b) Geedo duurjoogta ah oo nooca Arabidopsis Columbia (Col) ah oo toddoba maalmood jir ah ayaa lagu beeray saxanadaha Murashige iyo Skoog (MS) oo ay ku jiraan coumamonamide 6 ama coumamonamide 1 marka la eego xaddiga la tilmaamay. Barka cabbirka = 1 cm.
Marka hore, waxaan qiimeynay hawlaha bayoolojiga ee urbenamide iyo dhexdhexaadiyayaashiisa si ay u cabbiraan kartidooda ay u leeyihiin inay wax ka beddelaan koritaanka dhirta. Waxaan ku darnay uruurin kala duwan oo ursmonamide 1 ama ursmonic acid 6 ah geedo yaryar oo ah agar dhexdhexaad ah oo lagu beeray thaliana oo MS ah. Tijaabooyinkani waxay muujiyeen in uruurinta sare (500 μM) oo ah 6 ay joojisay koritaanka xididka (Jaantuska 2b). Marka xigta, waxaan soo saarnay noocyo kala duwan oo kala duwan annagoo beddelnay booska N1 ee 6 waxaanan ku sameynay daraasado xiriir qaab-dhismeed-hawleed iyaga (habka isku-darka analoogga ah waxaa lagu sharraxay Macluumaadka Taageerada (SI)). Geedaha Arabidopsis waxaa lagu beeray dhexdhexaad ka kooban 50 μM oo ah waxyaabaha ka soo baxa ursonic acid, dhererka xididkana waa la cabbiray. sida ku cad sawirka. Sida ku cad Jaantusyada 3a, b, iyo S1, asiidhyada coumamo waxay leeyihiin dherer kala duwan oo silsiladaha alkoxy toosan (9, 10, 11, 12, iyo 13) ama silsiladaha alkoxy ee waaweyn (15, 16, iyo 17) booska N1. Waxyaabaha laga soo saaray waxay muujiyeen xannibaad weyn oo ku saabsan koritaanka xididka. Intaa waxaa dheer, waxaan ogaanay in codsiga 200 μM 10, 11, ama 17 uu joojiyay biqilka (Jaantusyada 3c iyo S2).
Daraasad ku saabsan xiriirka qaab-dhismeedka iyo dhaqdhaqaaqa ee Kumamoto amide iyo isku-dhafka la xiriira. (a) Qaab-dhismeedka iyo qaab-dhismeedka analogues-ka. (b) Tirada dhererka xididka ee geedo 7-maalmood jir ah oo lagu beero MS oo leh ama aan lahayn 50 μM coumamonamide derivatives. Xiddiguhu waxay muujinayaan kala duwanaansho muhiim ah oo ku saabsan daaweynta beenta ah (t test, p< 0.05). n>18. Xogta waxaa loo muujiyay celcelis ahaan ± SD. nt macnaheedu waa "lama tijaabin" sababtoo ah in ka badan 50% iniinuhu ma aysan soo bixin. (c) Tirada heerka biqilka iniinaha la daweeyay ee lagu daweeyay 7 maalmood oo ku jira MS oo leh ama aan lahayn 200 μM coumamonamide iyo iskudhisyo la xiriira. Xiddiguhu waxay muujinayaan kala duwanaansho muhiim ah oo ku saabsan daaweynta sham (tijaabada chi-square). n=96.
Waxaa xiiso leh, ku darista silsiladaha dhinaca alkyl ee ka dheer C9 waxay yareysay dhaqdhaqaaqa xakamaynta, taasoo soo jeedinaysa in isku-dhafka la xiriira kumamotoic acid ay u baahan yihiin silsilado dhinac oo cabbir gaar ah leh si ay u muujiyaan dhaqdhaqaaqooda bayoolojiga.
Sababtoo ah falanqaynta xiriirka qaab-dhismeedka-dhaqdhaqaaqa ayaa muujisay in C9 loo beddelay ursonic acid iyo ka-soo-saarka nonyloxy ee ursonic acid (kadibna loogu yeero KAND 11) uu ahaa ka-hortagga koritaanka dhirta ugu waxtarka badan, waxaan sameynay sifeyn faahfaahsan oo KAND 11 ah. Daaweynta Arabidopsis oo leh 50 μM KAND 11 ku dhawaad si buuxda ayay uga hortagtay biqilka, halka heerarka hoose (40, 30, 20, ama 10 μM) ee KAND 11 ay joojisay koritaanka xididka si ku-tiirsan qiyaasta (Jaantuska 4a, b). Si loo tijaabiyo in KAND 11 ay saamayso jiritaanka xididka meristem, waxaan baarnay xididka meristem ee lagu rinjiyeeyay propidium iodide (PI) waxaanan cabbirnay cabbirka aagga meristem. Cabbirka meristem-ka ee geedo lagu beeray meel ay ku jirto 25 μM KAND-11 wuxuu ahaa 151.1 ± 32.5 μm, halka cabbirka meristem-ka ee geedo lagu beeray meel ay ku jirto DMSO uu ahaa 264.7 ± 30.8 μm (Jaantuska 4c, d), taas oo tilmaamaysa in KAND-11 uu soo celiyo dhaqdhaqaaqa unugyada. faafidda. Meristem-ka xididka. Iyada oo la raacayo tan, daaweynta KAND 11 waxay yareysay tirada calaamadda qaybinta unugyada CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS ee meristem-ka xididka (Jaantuska 4e) 17. Natiijooyinkani waxay muujinayaan in KAND 11 ay joojiso koritaanka xididka iyadoo yareysa dhaqdhaqaaqa taranka unugyada.
Falanqaynta saameynta xannibaadda ee derivatives urbenonic acid (urbenyloxy derivatives) ee koritaanka. (a) Geedo 7-maalmood jir ah oo nooca Col ah oo lagu beero taarikada MS oo leh fiirsashada la tilmaamay ee KAND 11. Barta miisaanka = 1 cm. (b) Tirada dhererka xididka. Xarfaha waxay muujinayaan kala duwanaansho muhiim ah (Tukey HSD test, p< 0.05). n>16. Xogta waxaa loo muujiyay celcelis ahaan ± SD. (c) Mikroskoobka isku-dhafan ee xididdada nooca duurjoogta ah ee propidium iodide-ka lagu dahaadhay ee Col ee lagu beeray taarikada MS oo leh ama aan lahayn 25 μM KAND 11. Qaanso cad ayaa tilmaamaya xididka meristem. Barkadda miisaanka = 100 µm. (d) Tirada cabbirka xididka meristem (n = 10 ilaa 11). Kala duwanaanshaha tirakoobka waxaa lagu go'aamiyay iyadoo la isticmaalayo t-test (p< 0.05). Baararka waxay matalaan cabbirka celceliska meerista. (e) Mikroskoobka kala duwanaanshaha faragelinta (DIC) ee meerista xididka oo ka kooban dhismaha CDKB2; 1pro: CDKB2; 1-GUS oo lagu rinjiyeeyay oo lagu rinjiyeeyay geedo 5-maalmood jir ah oo lagu beeray taarikada MS iyadoo la adeegsanayo ama aan lahayn 25 µM KAND tijaabo ah.
Sunta sunta ah ee KAND 11 ayaa si dheeraad ah loo tijaabiyay iyadoo la adeegsanayo geed kale oo dicotyledonous ah, tubaakada (Nicotiana tabacum), iyo noole weyn oo ah nooca dhirta dhulka, liverwort (Marchantia polymorpha). Sida kiiska Arabidopsis, geedo yaryar oo tubaakada ah oo lagu beeray dhexdhexaad ka kooban 25 μM KAND 11 ayaa soo saaray xidido gaaban (Jaantuska 5a). Intaa waxaa dheer, 40 ka mid ah 48 iniin ayaa ku soo baxay saxanno ay ku jiraan 200 μM KAND 11, halka dhammaan 48 iniin ay ku soo baxeen warbaahin lagu daweeyay mock, taasoo muujinaysa in uruurinta sare ee KAND ay ahayd mid muhiim ah (p<0.05; chi test -square) ayaa joojisay biqilka tubaakada. (Jaantuska 5b). Intaa waxaa dheer, fiirsashada KAND 11 ee joojisay koritaanka bakteeriyada ee beerka waxay la mid ahayd fiirsashada waxtarka leh ee Arabidopsis (Jaantuska 5c). Natiijooyinkani waxay muujinayaan in KAND 11 uu joojin karo koritaanka noocyo kala duwan oo dhir ah. Kadib waxaan baarnay sunta suurtagalka ah ee isku-dhafka la xiriira orso monoamide ee noolaha kale, kuwaas oo kala ah unugyada HeLa ee aadanaha iyo Escherichia coli nooca DH5α, iyagoo ah wakiillo ka socda unugyada xayawaanka iyo bakteeriyada sare, siday u kala horreeyaan. Tiro taxane ah oo tijaabooyinka fidinta unugyada ah, waxaan ku aragnay in coumamonamide 1, coumamonamidic acid 6, iyo KAND 11 aysan saameyn ku yeelan koritaanka unugyada HeLa ama E. coli ee fiirsashada 100 μM (Jaantuska 5d, e).
Xannibaadda koritaanka ee KAND 11 ee noolaha aan Carabidopsis ahayn. (a) Geedo laba toddobaad jir ah oo tubaako SR-1 ah ayaa lagu beeray saxanno MS ah oo si toosan u taagan oo ay ku jiraan 25 μM KAND 11. (b) Geedo laba toddobaad jir ah oo tubaako SR-1 ah ayaa lagu beeray saxanno MS ah oo si toosan u taagan oo ay ku jiraan 200 μM KAND 11. (c) Burooyin laba toddobaad jir ah oo nooca duurjoogta ah oo Tak-1 ah oo lagu beeray saxanno Gamborg B5 ah oo leh fiirsashada la tilmaamay ee KAND 11. Fallaadhaha cas waxay muujinayaan unugyo yaryar oo joojiyay koritaanka muddada laba toddobaad ah gudahood. (d) Baaritaanka taranka unugyada ee unugyada HeLa. Tirada unugyada nool waxaa lagu cabbiray waqtiyo go'an iyadoo la isticmaalayo qalabka tirinta unugyada 8 (Dojindo). Sida xakamaynta, unugyada HeLa waxaa lagu daaweeyay 5 μg/ml actinomycin D (Act D), kaas oo joojiya qoraalka polymerase RNA wuxuuna sababaa dhimashada unugyada. Falanqaynta waxaa lagu sameeyay saddex-laab. (e) Baaritaanka fidinta unugyada E. coli. Kobaca E. coli waxaa lagu falanqeeyay iyadoo la cabbirayo OD600. Si loo xakameeyo, unugyada waxaa lagu daaweeyay 50 μg/ml ampicillin (Amp), taas oo joojisa sameynta darbiga unugyada bakteeriyada. Falanqaynta waxaa lagu sameeyay saddex-laab.
Si loo fahmo habka ficilka sunta sunta ee ay keento isku-dhafka la xiriira uramide, waxaan dib u falanqaynay waxyaabaha ka soo baxa urbenic acid oo leh saameyn dhexdhexaad ah oo xakameyn ah. sida ku cad sawirka. Sida ku cad Jaantusyada 2b, 6a, geedo yaryar oo lagu beeray saxannada agar oo ay ku jiraan xaddi badan (200 μM) oo ah urmotonic acid 6 waxay soo saareen xidido gaagaaban oo bidix-qaloocan (θ = - 23.7 ± 6.1), halka geedo yaryar oo lagu beeray habka xakamaynta, geedo yaryar ay soo saareen xidido toosan oo ku dhow (θ = - 3.8 ± 7.1). Kobaca sifadan ee aan la garanayn ayaa la ogyahay inuu ka dhashay cillad ka timaadda microtubules-ka cortical14,18. Iyada oo la raacayo natiijadan, daawooyinka microtubule-ka ee khalkhal geliya disopyramide iyo oryzalin waxay sababeen janjeedh xidid oo isku mid ah xaaladaha koritaankayaga (Jaantusyada 2b, 6a). Isla mar ahaantaana, waxaan tijaabinay waxyaabaha ka soo baxa urmotonic acid waxaanan doorannay dhowr ka mid ah kuwaas oo, marka la eego xaddi gaar ah, ay sababeen koritaanka xididka oo aan la garanayn. Isku-dhafka 8, 9, iyo 15 waxay beddeleen jihada koritaanka xididka 75 μM, 50 μM, iyo 40 μM, siday u kala horreeyaan, taasoo muujinaysa in isku-dhafkani uu si wax ku ool ah u carqaladeyn karo microtubules (Jaantuska 2b, 6a). Waxaan sidoo kale tijaabinay ka-soo-saarka ursolic acid ee ugu awoodda badan, KAND 11, oo leh diirad hoose (15 µM) waxaana ogaanay in codsiga KAND 11 uu xannibay koritaanka xididka iyo in jihada koritaanka xididka aysan sinnayn, inkastoo ay u janjeereen inay u janjeeraan dhanka bidix (Jaantuska C3). Sababtoo ah uruurinta sare ee daawooyinka microtubule-degaameeya mararka qaarkood waxay joojiyaan koritaanka dhirta halkii ay ka keeni lahaayeen janjeedhka xididka, waxaan markii dambe qiimeynay suurtagalnimada in KAND 11 uu saameeyo microtubules iyadoo la eegayo microtubules-ka cortical-ka ee unugyada epidermal-ka xididka. Immunohistochemistry oo isticmaalaya antibodies-ka anti-β-tubulin ee unugyada epidermal-ka ee xididdada geedaha ee lagu daaweeyay 25 μM KAND 11 waxay muujisay baaba'a ku dhawaad dhammaan microtubules-ka cortical-ka ee unugyada epidermal-ka ee aagga fidinta (Jaantuska 6b). Natiijooyinkani waxay muujinayaan in kumamotonic acid iyo waxyaabaha uu ka soo saaro ay si toos ah ama si dadban ugu dhaqmaan microtubules si ay u carqaladeeyaan iyo in isku-darkaani ay yihiin kuwa cusub ee joojiya microtubule.
Ursonic acid iyo waxyaabaha uu ka soo saaro waxay beddelaan microtubules cortical ee Arabidopsis thaliana. (a) Xagasha u janjeerta xididka ayaa lagu cabiray joogitaanka noocyo kala duwan oo ah derivatives urmotonic acid marka la eego xaddiga la tilmaamay. Saamaynta laba iskudhis oo loo yaqaan inay joojiyaan microtubules: disopyramide iyo oryzalin ayaa sidoo kale la falanqeeyay. Qaybta hoose waxay muujinaysaa heerka loo isticmaalo in lagu cabbiro xagasha koritaanka xididka. Xidigiska calaamaduhu waxay muujinayaan kala duwanaansho muhiim ah oo ku saabsan daaweynta beenta ah (t test, p< 0.05). n>19. Barkadda miisaanka = 1 cm. (b) Microtubules-ka cortical ee unugyada epidermal-ka ee aagga fidinta. Microtubules-ka ee nooca duurjoogta ah ee Arabidopsis Xididdada Col ee lagu beero taarikada MS oo leh ama aan lahayn 25 μM KAND 11 waxaa lagu sawiray rinjiyeynta immunohistochemical iyadoo la adeegsanayo antibodies-ka aasaasiga ah ee β-tubulin iyo antibodies-ka labaad ee isku xiran ee Alexa Fluor. Barkadda miisaanka = 10 µm. (c) Qaab-dhismeedka Mitotic ee microtubules-ka ee meristem-ka xididka. Microtubules-ka waxaa lagu sawiray iyadoo la isticmaalayo rinjiyeynta immunohistochemical. Qaab-dhismeedka Mitotic, oo ay ku jiraan aagagga prophase, spindles, iyo phragmoplasts, waxaa laga tiriyay sawirrada isku dhafan. Fallaadhaha waxay muujinayaan qaab-dhismeedka microtubule-ka mitotic. Xiddiguhu waxay muujinayaan kala duwanaansho muhiim ah oo ku saabsan daaweynta sham (tijaabada t, p< 0.05). n>9. Barta miisaanka = 50 µm.
In kasta oo Ursa ay awood u leedahay inay carqaladeyso shaqada microtubule, haddana waxaa la filayaa in farsamadeeda ficilku ay ka duwan tahay wakiilada microtubule ee caadiga ah. Tusaale ahaan, fiirsashada sare ee wakiilada microtubule ee depolymerizing sida disopyramide iyo oryzalin waxay kicisaa ballaarinta anisotropic ee unugyada epidermal, halka KAND 11 aysan kicin. Intaa waxaa dheer, isticmaalka wadajirka ah ee KAND 11 iyo disopyramide waxay keentay jawaab celin isku dhafan oo koritaanka xididka ah oo disopyramide ah iyo joojinta koritaanka ee KAND 11 ayaa la arkay (Jaantuska S4). Waxaan sidoo kale falanqaynay jawaabta mutant-ka disopyramide 1-1 (phs1-1) ee xasaasiga ah ee KAND 11. phs1-1 waxay leedahay isbeddel dhibic ah oo aan ahayn kanonical tubulin kinase waxayna soo saartaa xididdo gaaban marka lagu daaweeyo disopyramide9,20. Geedo mutant ah oo phs1-1 ah oo lagu beeray agar dhexdhexaad ah oo ka kooban KAND 11 waxay lahaayeen xididdo gaaban oo la mid ah kuwa lagu beeray disopyramid (Jaantuska S5).
Intaa waxaa dheer, waxaan ku aragnay qaab-dhismeedka mitotic microtubule, sida aagagga prophase, spindles, iyo phragmoplasts, xididka meristem ee geedo lagu daaweeyay KAND 11. Iyada oo la raacayo indha-indheynta CDKB2;1p::CDKB2;1-GUS, hoos u dhac weyn ayaa lagu arkay tirada mitotic microtubules (Jaantuska .6c).
Si loo garto sunta sunta ah ee KAND 11 marka la isticmaalayo xalka unugyada hoose, waxaan ku daweynay unugyada joojinta tubaakada BY-2 KAND 11 waxaanan aragnay jawaabtooda. Marka hore waxaan ku darnay KAND 11 unugyada BY-2 ee muujinaya TagRFP-TUA6, kuwaas oo si fluorescent ah ugu calaamadeeya microtubules, si loo qiimeeyo saameynta KAND 11 ee microtubules-ka cortical. Cufnaanta microtubule-ka cortical waxaa lagu qiimeeyay iyadoo la adeegsanayo falanqaynta sawirka, taas oo cabbirtay boqolleyda pixels-ka cytoskeletal ee u dhexeeya pixels-ka cytoplasmic. Natiijooyinka tijaabada ayaa muujiyay in ka dib markii lagu daaweeyay 50 μM ama 100 μM KAND 11 muddo 1 saac ah, cufnaanta ayaa si weyn hoos ugu dhacday 0.94 ± 0.74% ama 0.23 ± 0.28%, siday u kala horreeyaan, halka cufnaanta unugyada lagu daaweeyay DMSO, ay ahayd 1.61 ± 0.34% (Jaantuska 7a). Natiijooyinkani waxay la jaan qaadayaan aragtida Arabidopsis ee ah in daaweynta KAND 11 ay kiciso depolymerization-ka microtubules-ka cortical (Jaantuska 6b). Waxaan sidoo kale baarnay xariiqda BY-2 oo leh fiilooyinka actin-ka ee lagu calaamadeeyay GFP-ABD ka dib markii lagu daaweeyay isla isku-darka KAND 11 waxaana aragnay in daaweynta KAND 11 ay carqaladeysay fiilooyinka actin. Daaweynta 50 μM ama 100 μM KAND 11 muddo 1 saac ah ayaa si weyn hoos ugu dhigtay cufnaanta fiilooyinka actin ilaa 1.20 ± 0.62% ama 0.61 ± 0.26%, siday u kala horreeyaan, halka cufnaanta unugyada lagu daaweeyay DMSO ay ahayd 1.69 ± 0.51% (Jaantuska 2). 7b). Natiijooyinkani waxay ka soo horjeedaan saameynta propyzamide, kaas oo aan saameyn fiilooyinka actin, iyo latrunculin B, oo ah depolymerizer actin ah oo aan saameyn ku yeelan microtubules (Jaantuska SI S6). Intaa waxaa dheer, daawaynta coumamonamide 1, coumamonamide acid 6, ama KAND 11 ma saameyn microtubules-ka unugyada HeLa (SI Jaantuska S7). Sidaa darteed, habka ficilka KAND 11 waxaa la rumeysan yahay inuu ka duwan yahay kan khalkhal-geliyayaasha cytoskeleton-ka ee la yaqaan. Intaa waxaa dheer, indha-indheynteena yar ee unugyada BY-2 ee lagu daaweeyay KAND 11 ayaa shaaca ka qaaday bilawga dhimashada unugyada inta lagu jiro daaweynta KAND 11 waxayna muujisay in saamiga unugyada dhintay ee buluugga ah ee Evans uusan si weyn u kordhin ka dib 30 daqiiqo oo daaweyn KAND 11 ah, halka ka dib 90 daqiiqo oo daaweyn ah oo lagu sameeyay 50 μM ama 100 μM KAND, tirada unugyada dhintay ay kor u kacday 43.7% ama 80.1%, siday u kala horreeyaan (Jaantuska 7c). Marka la isku soo wada duubo, xogtani waxay muujinaysaa in KAND 11-ka cusub ee ka soo jeeda ursolic acid uu yahay cytoskeletal inhibitor ah oo dhirta u gaar ah oo leh farsamo ficil oo aan hore loo aqoon.
KAND waxay saameysaa microtubules-ka cortical, fiilooyinka actin, iyo jiritaanka unugyada BY-2 ee tubaakada. (a) Muuqaalka microtubules-ka cortical-ka ee unugyada BY-2 iyadoo ay joogaan TagRFP-TUA6. Unugyada BY-2 ee lagu daaweeyay KAND 11 (50 μM ama 100 μM) ama DMSO waxaa lagu baaray mikroskoobka confocal. Cufnaanta microtubule-ka cortical waxaa laga xisaabiyay mikroskoobyo 25 unug oo madax-bannaan. Xarfaha waxay muujinayaan kala duwanaansho muhiim ah (tijaabada Tukey HSD, p< 0.05). Barka cabbirka = 10 µm. (b) Fiilooyinka actin-ka ee unugyada BY-2 ee lagu sawiray joogitaanka GFP-ABD2. Unugyada BY-2 ee lagu daaweeyay KAND 11 (50 μM ama 100 μM) ama DMSO waxaa lagu baaray mikroskoob isku dhafan. Cufnaanta fiilooyinka actin-ka ee cortical waxaa laga xisaabiyay mikroskoobyo 25 unug oo madax-bannaan. Xarfaha waxay muujinayaan kala duwanaansho muhiim ah (tijaabada Tukey HSD, p< 0.05). Barkadda miisaanka = 10 µm. (c) Daawashada unugyada BY-2 ee dhintay iyadoo la adeegsanayo rinjiga buluugga ah ee Evans. Unugyada BY-2 ee lagu daweeyay KAND 11 (50 μM ama 100 μM) ama DMSO waxaa lagu baaray mikroskoob goob dhalaalaya. n=3. Barkadda miisaanka = 100 µm.
Helitaanka iyo adeegsiga alaabada cusub ee dabiiciga ah ayaa horseeday horumarro muhiim ah oo ku saabsan dhinacyo kala duwan oo nolosha aadanaha ah, oo ay ku jiraan daawada iyo beeraha. Cilmi-baaris taariikhi ah ayaa la sameeyay si loo helo isku-dhafan waxtar leh oo ka yimaada kheyraadka dabiiciga ah. Gaar ahaan, actinomycetes waxaa loo yaqaanaa inay faa'iido u leeyihiin antibiyootigyada ka hortagga dulinleyda ee nematodes sababtoo ah awooddooda ay ku soo saari karaan metabolites-ka heerka labaad ee kala duwan sida avermectin, isku-darka hormuudka ah ee ivermectin iyo bleomycin iyo waxyaabaha ka soo baxa, oo loo isticmaalo daawo ahaan wakiilka ka hortagga kansarka21,22. Sidoo kale, noocyo kala duwan oo isku-dhafan oo lagu dilo geedaha ayaa laga helay actinomycetes, kuwaas oo qaarkood horey loogu isticmaalay ganacsi ahaan1,23. Sidaa darteed, falanqaynta metabolites-ka actinomycete si loo kala saaro alaabada dabiiciga ah ee leh hawlaha bayoolojiga ee la doonayo waxaa loo arkaa istaraatiijiyad wax ku ool ah. Daraasaddan, waxaan ku ogaanay isku-darka cusub, coumamonamide, oo ka yimid S. werraensis waxaanan si guul leh u soo saarnay. Ursonic acid waa dhexdhexaad macmal ah oo urbenamide iyo waxyaabaha ka soo baxa. Waxay sababi kartaa xididka oo si gaar ah u duubma, waxay muujisaa dhaqdhaqaaq dhireed oo dhexdhexaad ah ilaa mid xooggan, waxayna si toos ah ama si dadban u waxyeelayn kartaa microtubules-ka dhirta. Si kastaba ha ahaatee, habka ficilka urmotonic acid wuu ka duwanaan karaa kan daawooyinka microtubule ee jira, maadaama KAND 11 uu sidoo kale carqaladeeyo fiilooyinka actin wuxuuna sababaa dhimashada unugyada, taasoo soo jeedinaysa hab nidaamin ah oo ay urmotonic acid iyo waxyaabaha ka soo baxa ay saameeyaan qaabab kala duwan oo cytoskeletal ah.
Sifeynta faahfaahsan ee aashitada urbenonic waxay kaa caawin doontaa inaad si fiican u fahamto habka ficilka aashitada urbenonic. Gaar ahaan, yoolka xiga waa in la qiimeeyo awoodda ursonic acid uu ugu xidhmo microtubules-ka la dhimay si loo go'aamiyo in ursonic acid iyo waxyaabaha ka soo baxa ay si toos ah ugu dhaqmaan microtubules-ka oo ay ka saaraan iyaga, ama haddii ficilkoodu uu keeno xasillooni-darrada microtubule. Intaa waxaa dheer, haddii microtubules-ku aysan ahayn bartilmaameed toos ah, aqoonsashada goobta ficilka iyo bartilmaameedyada molecular-ka ee ursonic acid ee unugyada dhirta ayaa kaa caawin doonta inaad si dheeraad ah u fahamto sifooyinka isku-dhafka la xiriira iyo siyaabaha suurtagalka ah ee lagu hagaajin karo dhaqdhaqaaqa dhirta lagu dilo. Tijaabintayada firfircoonida bayoolojiga ayaa muujisay awoodda gaarka ah ee cytotoxic ee ursonic acid ee koritaanka dhirta sida Arabidopsis thaliana, tubaakada iyo beerka, halka unugyada E. coli iyo HeLa midkoodna aysan saameyn. Sunta yar ama ma jirto ee unugyada xayawaanka waa faa'iido ka mid ah waxyaabaha ka soo baxa aashitada ursonic haddii loo horumariyo sidii geedo yaryar oo loogu isticmaalo beeraha furan. Runtii, maadaama microtubules ay yihiin qaab-dhismeedyo caadi ah oo ku jira eukaryotes, xannibaadooda xulashada ee dhirta waa shuruud muhiim u ah geedaha lagu dilo. Tusaale ahaan, propyzamide, oo ah wakiil microtubule depolymerizing ah oo si toos ah ugu xidhma tubulin oo joojiya polymerization, ayaa loo isticmaalaa sidii cayayaan dilaha ah sababtoo ah suntiisa yar ee unugyada xayawaanka24. Marka la barbardhigo disopyramide, benzamides-ka la xiriira waxay leeyihiin sifooyin bartilmaameed oo kala duwan. Marka lagu daro microtubules-ka dhirta, RH-4032 ama benzoxamide waxay sidoo kale joojisaa microtubules-ka unugyada xayawaanka ama oomycetes, siday u kala horreeyaan, zalilamide-na waxaa loo isticmaalaa sidii fungicidal sababtoo ah suntiisa hoose ee phytotoxicity25,26,27. Orso-da cusub ee la helay iyo waxyaabaha ka soo baxa waxay muujinayaan sunta cytotoxicity ee ka dhanka ah dhirta, laakiin waxaa xusid mudan in wax-ka-beddello dheeraad ah ay beddeli karaan gaar ahaanshaha bartilmaameedkooda, taasoo suurtogal ah inay bixiso waxyaabo dheeraad ah oo lagu xakameeyo fangaska cudurada keena ama oomycetes.
Sifooyinka gaarka ah ee asiidhka urbenonic iyo waxyaabaha ka soo baxa ayaa faa'iido u leh horumarkooda sida geedaha lagu buufiyo iyo isticmaalka qalabka cilmi-baarista. Muhiimadda cytoskeleton ee xakamaynta qaabka unugyada dhirta ayaa si weyn loo aqoonsaday. Daraasado hore ayaa muujiyay in dhirtu ay horumariyeen habab adag oo ah abaabulka microtubule-ka cortical iyagoo xakameynaya dhaqdhaqaaqa microtubule si ay si habboon u xakameeyaan morphogenesis. Tiro badan oo molecules ah oo mas'uul ka ah nidaaminta dhaqdhaqaaqa microtubule ayaa la aqoonsaday, cilmi-baarista la xiriirtana wali way socotaa3,4,28. Fahamkeenna hadda ee ku saabsan dhaqdhaqaaqa microtubule ee unugyada dhirta si buuxda uma sharraxayo hababka abaabulka microtubule-ka cortical. Tusaale ahaan, inkastoo labadaba disopyramide iyo oryzalin ay ka saari karaan microtubules-ka, disopyramide wuxuu keenaa qallooc xidid oo daran halka oryzalin uu leeyahay saameyn khafiif ah. Intaa waxaa dheer, isbeddellada ku yimaada tubulin, kaas oo xasiliya microtubules, ayaa sidoo kale sababa dextrorotation xididdada, halka paclitaxel, oo sidoo kale xasiliya dhaqdhaqaaqa microtubule, uusan sameyn. Sidaa darteed, barashada iyo aqoonsashada bartilmaameedyada molecular-ka ee ursolic acid waa inay bixisaa aragtiyo cusub oo ku saabsan nidaaminta microtubules-ka cortical-ka dhirta. Sidoo kale, isbarbardhigga mustaqbalka ee kiimikooyinka waxtarka u leh kor u qaadista koritaanka qalloocan, sida disopyramide, iyo kiimikooyinka aan waxtarka lahayn, sida oryzalin ama kumamotoric acid, ayaa bixin doona tilmaamo ku saabsan sida koritaanka qalloocan u dhaco.
Dhanka kale, dib-u-habaynta unugyada difaaca ee la xiriira difaaca ayaa ah suurtagal kale oo lagu sharxi karo sunta ursonic acid. Caabuqa cudur-sidaha ama soo bandhigidda unug-sidaha unugyada dhirta mararka qaarkood waxay sababtaa burburka unugyada iyo dhimashada unugyada dambe29. Tusaale ahaan, cryptoxanthin-ka laga helo oomycete ayaa la sheegay inuu carqaladeeyo microtubules iyo fiilooyinka actin ka hor dhimashada unugyada tubaakada, oo la mid ah waxa ka dhaca daaweynta KAND30,31. Isku ekaanshaha u dhexeeya jawaabaha difaaca iyo jawaabaha unugyada ee ay keento ursonic acid ayaa naga dhigtay inaan qiyaasno inay kiciyaan hababka unugyada caadiga ah, inkastoo saameyn degdeg ah oo xooggan oo ursonic acid ah marka loo eego cryptoxanthin ay muuqato. Si kastaba ha ahaatee, daraasaduhu waxay muujiyeen in carqaladaynta fiilooyinka actin ay kor u qaaddo dhimashada unugyada iskeed u dhacda, taas oo aan had iyo jeer la socon khalkhalka microtubule29. Intaa waxaa dheer, waxaa weli la arki doonaa in cudur-sidaha ama kiciyaha uu keeno koritaanka xididka oo qalloocan, sida waxyaabaha ka soo baxa ursonic acid ay sameeyaan. Sidaa darteed, aqoonta molecular-ka ee isku xirta jawaabaha difaaca iyo cytoskeleton waa dhibaato soo jiidasho leh oo wax laga qabanayo. Iyadoo laga faa'iideysanayo jiritaanka iskudhisyo miisaankoodu hooseeyo oo la xiriira ursonic acid, iyo sidoo kale noocyo kala duwan oo ka soo jeeda oo leh awoodo kala duwan, waxay bixin karaan fursado lagu bartilmaameedsado hababka unugyada aan la aqoon.
Marka la isku soo wada duubo, helitaanka iyo adeegsiga iskudhisyo cusub oo wax ka beddela dhaqdhaqaaqa microtubule waxay bixin doonaan habab awood leh si wax looga qabto hababka isku-dhafan ee molecular-ka ee salka ku haya go'aaminta qaabka unugyada dhirta. Xaaladdan oo kale, isku-darka urmotonic acid ee dhawaan la sameeyay, kaas oo saameeya microtubules iyo fiilooyinka actin isla markaana sababa dhimashada unugyada, ayaa laga yaabaa inuu bixiyo fursad lagu fahmo xiriirka ka dhexeeya xakamaynta microtubule iyo hababka kale. Sidaa darteed, falanqaynta kiimikada iyo bayoolojiga iyadoo la adeegsanayo urbenonic acid waxay naga caawin doontaa inaan fahanno hababka sharciyeynta molecular-ka ee xakameeya cytoskeleton-ka dhirta.
Ku tallaal S. werraensis MK493-CF1 dhalo Erlenmeyer ah oo 500 mL ah oo qasan oo ka kooban 110 mL oo ah iniin dhexdhexaad ah oo ka kooban 2% (w/v) galactose, 2% (w/v) koollada Essence, 1% (w/v) Halabuurka Bacto. -soyton (Thermo Fisher Scientific, Inc.), 0.5% (w/v) soosaarka galleyda (KOGOSTCH Co., Ltd., Japan), 0.2% (w/v) (NH4)2SO4 iyo 0.2% CaCO3 oo lagu shubay biyo la miiray. (pH 7.4 ka hor inta aan la nadiifin). Dhaqanka iniinaha waxaa lagu kululeeyay shaker wareeg ah (180 rpm) heerkul ah 27°C muddo 2 maalmood ah. Beerista wax soo saarka iyada oo loo marayo halsano adag. Abuurka abuurka (7 ml) waxaa loo wareejiyay dhalo K-1 ah oo 500 ml ah oo ka kooban 40 g oo ah wax soo saar oo ka kooban 15 g oo shaciir ah oo la riixay (MUSO Co., Ltd., Japan) iyo 25 g oo biyo ah oo la baabi'iyay (pH lama hagaajin ka hor inta aan la nadiifin). Khamiirinta waxaa lagu sameeyay heerkul ah 30°C mugdiga muddo 14 maalmood ah. Walxaha khamiirinta waxaa lagu soo saaray 40 ml/dhalo EtOH ah waxaana lagu dhex geliyay centrifuge (1500 g, 4°C, 10 daqiiqo). Ka-soo-baxa dhaqanka (60 ml) waxaa lagu soo saaray isku-darka 10% MeOH/EtOAc. Lakabka dabiiciga ah ayaa la uumibixiyey iyadoo cadaadis yar la saaray si loo helo haraaga (59.5 mg), kaas oo lagu sameeyay HPLC oo leh jajabka jilicsan (0–10 daqiiqo: 90%) tiir wejiga dambe (SHISEIDO CAPCELL PAK C18 UG120, 5 μm, ID 10 mm × dherer 250 mm) H2O/CH3CN, 10–35 daqiiqo: 90% H2O/CH3CN ilaa 70% H2O/CH3CN (jaangooyo), 35–45 daqiiqo: 90% H2O/EtOH, 45–155 daqiiqo: 90% H2O/EtOH ilaa 100% EtOH (jaangooyo (jaangooyo), 155–200 daqiiqo: 100% EtOH) heerka socodka 1.5 ml/daqiiqo, coumamonamide (1, 36.0 mg) waxaa loo kala saaray sidii budo cad oo aan qaab lahayn.
Kumamotoamide(1); 1H-NMR (500 MHz, CDCl3) δ 6.93 (t, J = 2.5 Hz, 1H), 6.76 (dd, J = 4.3, 1.8 Hz 1H), 6.05 (t , J = 3.8 Hz, 1H). ), 4.08 (s, 3H); 13C-NMR (125 MHz, CDCl3) δ 161.1, 121.0, 119.9, 112.2, 105.0, 68.3; ESI-HRMS [M+H]+: [C6H9N2O2]+ qiimaha la xisaabiyay: 141.0659, qiimaha la cabbiray: 141.0663, IR νmax 3451, 3414, 3173, 2938, 1603, 1593, 1537 cm–1.
Abuurka Columbia (Col-0) waxaa laga helay Xarunta Kheyraadka Bayoolojiga ee Arabidopsis (ABRC) iyadoo la oggolaaday isticmaalka cilmi-baarista. Abuurka Col-0 waxaa lagu faafiyay oo lagu hayay xaaladaha shaybaarka waxaana loo isticmaalay sidii dhir nooc duurjoog ah oo Arabidopsis ah. Abuurka Arabidopsis waxaa lagu nadiifiyay dusha sare waxaana lagu beeray Murashige iyo Skoog dhexdhexaad ah oo nus xoog leh oo ay ku jiraan 2% sucrose (Fujifilm Wako Pure Chemical), 0.05% (w/v) 2-(4-morpholino)ethanesulfonic acid (MES) (Fujifilm Wako Pure Chemical). ) iyo 1.5% agar (Fujifilm Wako Pure Chemical), pH 5.7, heerkul ah 23 °C iyo iftiin joogto ah. Abuurka mutant-ka phs1-1 waxaa bixiyay T. Hashimoto (Machadka Sayniska iyo Teknolojiyadda Nara).
Iniinyaha nooca SR-1 waxaa bixiyay T. Hashimoto (Machadka Sayniska iyo Teknolojiyadda ee Nara) waxaana loo isticmaalay sidii dhir tubaako oo duurjoog ah. Iniinaha tubaakada waxaa lagu nadiifiyay dusha sare waxaana lagu qooyay biyo nadiif ah muddo saddex habeen ah si kor loogu qaado biqilka, ka dibna waxaa la geliyay xal nus-xoog ah oo ka kooban 2% sucrose, 0.05% (w/v) MES, iyo 0.8% xanjo gellan ah (Fujifilm Wako Pure Chemical) Murashige. iyo Skoog medium) oo leh pH 5.7 waxaana lagu kululeeyay 23°C iyadoo la iftiiminayo.
Tak-1 waxaa bixiyay T. Kohchi (Jaamacadda Kyoto) waxaana loo isticmaalay sidii cutub tijaabo ah oo caadi ah oo loogu talagalay daraasadda beerka. Gemma waxaa laga helay dhir la warshadeeyay oo la nadiifiyay ka dibna lagu dahaadhay Gamborg B5 dhexdhexaad ah (Fujifilm Wako Pure Chemical) oo ka kooban 1% sucrose iyo 0.3% xanjo jellan ah waxaana lagu kululeeyay heerkul ah 23°C iyadoo la adeegsanayo iftiin joogto ah.
Unugyada tubaakada BY-2 (Nicotiana tabacum L. cv. Bright Yellow 2) waxaa bixiyay S. Hasezawa (Jaamacadda Tokyo). Unugyada BY-2 waxaa lagu qasi jiray 95-laab gudaha Linsmeier iyo Skoog oo wax laga beddelay waxaana lagu kabi jiray toddobaadle 2,4-dichlorophenoxyacetic acid 32. Joojinta unugga waxaa lagu qasay shaker wareeg ah 130 rpm 27°C mugdiga. Ku dhaq unugyada 10 jeer mugga dhexdhexaadka cusub oo dib u jooji isla dhexdhexaadka. Khadadka unugyada BY-2 ee transgenic oo si adag u muujinaya calaamadda microtubule TagRFP-TUA6 ama calaamadda fiilada actin GFP-ABD2 ee hoos timaada fayraska cauliflower mosaic 35S promoter ayaa la soo saaray sida lagu sharaxay33,34,35. Khadadkan unugyada waa la ilaalin karaa oo la isku waafajin karaa iyadoo la adeegsanayo habab la mid ah kuwa loo isticmaalay khadka unugga asalka ah ee BY-2.
Unugyada HeLa waxaa lagu beeray habka wax laga beddelay ee Eagle's medium (DMEM) (Life Technologies) ee Dulbecco oo lagu daray 10% seeramka lo'da ee uurjiifka, 1.2 U/ml penicillin, iyo 1.2 μg/ml streptomycin oo ku jira qalab kuleyl ah oo 37°C ah oo leh 5% CO2.
Dhammaan tijaabooyinka lagu sharraxay qoraalkan waxaa lagu sameeyay iyadoo la raacayo xeerarka iyo tilmaamaha badbaadada bayoolojiga ee Japan.
Isku-dhafka waxaa lagu milmay dimethyl sulfoxide (DMSO; Fujifilm Wako Pure Chemical) iyadoo loo adeegsanayo xalal kayd ah waxaana lagu qasi jiray dhexdhexaadka MS ee Arabidopsis iyo tubaakada ama dhexdhexaadka Gamborg B5 ee beerka. Tijaabada joojinta koritaanka xididka, in ka badan 10 abuur halkii saxan ayaa lagu beeray dhexdhexaadka agar oo ay ku jiraan isku-dhafka la tilmaamay ama DMSO. Iniinaha waxaa lagu beeray qol koritaan muddo 7 maalmood ah. Iniinaha waxaa la sawiray oo dhererka xididdada ayaa la cabbiray. Tijaabada biqilka Arabidopsis, 48 abuur halkii saxan ayaa lagu beeray dhexdhexaadka agar oo ay ku jiraan isku-darka 200 μM ama DMSO. Iniinaha Arabidopsis waxaa lagu beeray qol koritaan waxaana la tiriyay tirada geedo soo baxay 7 maalmood ka dib biqilka (dag). Tijaabada biqilka tubaakada, 24 abuur halkii saxan ayaa lagu beeray dhexdhexaadka agar oo ay ku jiraan 200 μM KAND ama DMSO. Iniinaha tubaakada waxaa lagu beeray qol koritaan waxaana la tiriyay tirada geedo soo baxay 14 maalmood ka dib. Tijaabada xakamaynta koritaanka beerka, 9 uurjiif oo laga soo qaaday saxan kasta ayaa lagu dahaadhay agar dhexdhexaad ah oo ay ku jiraan xaddiga la tilmaamay ee KAND ama DMSO waxaana lagu dhex geliyay qol koritaan muddo 14 maalmood ah.
Adeegso geedo yaryar oo lagu rinjiyeeyay 5 mg/ml propidium iodide (PI) si aad u aragto qaab-dhismeedka xididka. Calaamadaha PI waxaa lagu arkay mikroskoob fluorescence iyadoo la adeegsanayo mikroskoobka sawir-qaadista laser-ka ee confocal TCS SPE (Leica Microsystems).
Rinjiyeynta histochemical ee xididdada iyadoo la adeegsanayo β-glucuronidase (GUS) ayaa la sameeyay iyadoo la raacayo hab-raaca ay sharxeen Malami iyo Benfey36. Geedaha waxaa lagu hagaajiyay 90% acetone habeenkii, iyadoo lagu rinjiyeeyay 0.5 mg/ml 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-d-glucuronic acid oo ku jirta GUS buffer muddo 1 saac ah ka dibna lagu riday xal chloraldehyde ah oo biyo lagu shubay. (8 g chloral hydrate, 2 ml biyo ah iyo 1 ml glycerol) waxaana lagu arkay iyadoo la adeegsanayo microscopy kala duwanaansho ah iyadoo la isticmaalayo mikroskoobka Axio Imager M1 (Carl Zeiss).
Xaglaha xididka waxaa lagu cabiray geedo 7 maalmood jir ah oo lagu beeray saxanno toosan. Cabbir xagasha xididka laga bilaabo jihada vector-ka cufisjiidadka sida lagu sharaxay tallaabada 6.
Habaynta microtubules-ka cortical-ka ayaa la arkay sida lagu sharraxay, iyadoo wax laga beddelay hab-raaca 37. Antibody-ga Anti-β-tubulin (KMX-1, Merk Millipore: MAB3408) iyo Alexa Fluor 488-conjugated anti-mouse IgG (Thermo Fisher Scientific: A32723) ayaa loo isticmaalay sidii antibody-yada aasaasiga ah iyo kuwa sare ee 1:1000 iyo 1:100 milmi, siday u kala horreeyaan. Sawirada fluorescence-ka waxaa lagu helay iyadoo la adeegsanayo mikroskoobka iskaanka laser-ka ee confocal TCS SPE (Leica Microsystems). Soo qaado sawirrada Z-stack oo samee saadaasha xoogga ugu badan sida waafaqsan tilmaamaha soo saaraha.
Tijaabada faafinta unugyada HeLa waxaa lagu sameeyay iyadoo la adeegsanayo Qalabka Tirinta Unugyada 8 (Dojindo) sida ku cad tilmaamaha soo saaraha.
Kobaca E. coli DH5α waxaa lagu falanqeeyay iyadoo la cabbirayo cufnaanta unugyada ee dhaqanka iyadoo la adeegsanayo spectrophotometer oo ah 600 nm (OD600).
Ururinta Cytoskeletal ee unugyada BY-2 ee transgenic ayaa lagu arkay iyadoo la adeegsanayo mikroskoob fluorescence ah oo lagu qalabeeyay qalabka iskaanka confocal CSU-X1 (Yokogawa) iyo kamarad sCMOS ah (Zyla, Andor Technology). Cufnaanta Cytoskeletal waxaa lagu qiimeeyay falanqaynta sawirka, taas oo cabbirtay boqolleyda pixels cytoskeletal ee u dhexeeya pixels cytoplasmic ee sawirada confocal iyadoo la adeegsanayo software ImageJ sida lagu sharaxay38,39.
Si loo ogaado dhimashada unugyada ee unugyada BY-2, qayb ka mid ah joojinta unugyada waxaa lagu kululeeyay 0.05% buluug Evans ah muddo 10 daqiiqo ah heerkulka qolka. Midabka buluugga ah ee Evans ee la xushay ee unugyada dhintay wuxuu ku xiran yahay soo saarista rinjiga unugyada nool iyadoo la adeegsanayo xuubka balaasmaha ee aan dhammaanayn40. Unugyada wasakhaysan waxaa lagu arkay iyadoo la adeegsanayo mikroskoob goob dhalaalaya (BX53, Olympus).
Unugyada HeLa waxaa lagu beeray DMEM iyadoo lagu kabay 10% FBS oo ku jira weel qoyan oo heerkulkiisu yahay 37°C iyo 5% CO2. Unugyada waxaa lagu daaweeyay 100 μM KAND 11, kumamonamic acid 6, kumamonamide 1, 100 ng/ml colcemid (Gibco), ama 100 ng/ml Nocodmaze (Sigma) muddo 6 saacadood ah heerkul ah 37°C. Unugyada waxaa lagu hagaajiyay MetOH muddo 10 daqiiqo ah ka dibna waxaa lagu daray acetate muddo 5 daqiiqo ah heerkulka qolka. Unugyada go'an waxaa lagu daray antibody-ga aasaasiga ah ee β-tubulin (1D4A4, Proteintech: 66240-1) oo lagu qasi jiray 0.5% BSA/PBS muddo 2 saacadood ah, waxaa lagu dhaqay 3 jeer TBST, ka dibna waxaa lagu daray antibody-ga riyaha Alexa Fluor. 488 1 saac. – Jiirka IgG (Thermo Fisher Scientific: A11001) iyo 15 ng/ml 4′, 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) oo lagu qasi jiray 0.5% BSA/PBS. Saddex jeer ka dib markii lagu dhaqay TBST, unugyada wasakhaysan ayaa lagu arkay mikroskoobka Nikon Eclipse Ti-E ee la rogay. Sawirada waxaa lagu qabtay kamarad Hamamatsu ORCA-R2 CCD ah oo qaboojisay iyadoo la adeegsanayo barnaamijka MetaMorph (Qalabka Molecular).
Waqtiga boostada: Juun-17-2024